Je m’appelle Jarlath Nally, et je fais partie de l’équipe de recherche ici au National Animal Disease Center à Ames, Iowa, et nous travaillons sur la leptospirose. La leptospirose est une maladie négligée. C’est une maladie mondiale.
Et vraiment, nous avons une compréhension très limitée de la façon dont ces groupes uniques de bactéries causent l’infection. La présentation d’aujourd’hui vise donc à fournir un aperçu d’un nouvel outil disponible pour faciliter l’évaluation des mécanismes pathogènes de la leptospirose en faisant taire spécifiquement des gènes spécifiques exprimés par leptospira, à l’aide d’une technique appelée interférence CRISPR. Cependant, la capacité de sélectionner des colonies de newtons dépend beaucoup de la fourniture du meilleur support de croissance pour ces leptospiras fastidieux.
Donc, tout d’abord, nous allons vous présenter Rick Hornsby, qui a très brièvement présenté un nouveau média pour propager ces bactéries fastidieuses. Et puis nous vous présenterons Louis Fernandez, qui parlera de la méthodologie d’interférence CRISPR pour faire taire les gènes cibles dans le leptospira. Bonjour, je m’appelle Rick Hornsby.
Depuis leur identification par Anada il y a plus de 100 ans, les leptospiras ont généralement été isolés et multipliés à 29 degrés Celsius, une température qui ne reflète ni l’environnement ni la température du corps hôte des mammifères. Il y a 10 ans, l’USDA ERS a commencé à rechercher des améliorations sur les milieux leptospira et à partir de cette recherche, le milieu Hornsby-Alt-Nally a été développé. Grâce à ce milieu, les cliniciens et les chercheurs ont pu isoler et propager plus rapidement les leptospiras à partir de cas sur le terrain et de recherches in vitro à une température et dans un environnement qui émulent plus étroitement l’hôte mammifère.
Nous continuons d’optimiser ce milieu, mais en l’état, han a démontré le potentiel d’améliorer considérablement les isolements cliniques vétérinaires et humains recherche in vitro et le développement de vaccins plus efficaces pour la prévention de la leptospirose. Bonjour, je m’appelle Louis Fernandez. Jusqu’ici, la pathogénie de la leptospirose est demeurée sous-explorée, principalement en raison du manque de tubes génétiques efficaces et faciles à exécuter.
Ici, nous allons décrire une nouvelle technique appelée interférence CRISPR ou CRISPRi. Et cette technique est très simple parce que nous n’avons besoin d’exprimer que deux composants, une protéine de liaison à l’ADN appelée Cas9 mort, ou dCas9, et une molécule d’ARN chimérique appelée ARN monoguide. Et le complexe dCas9 et l’ARN guide vont faire l’appariement de base à notre gène cible et donc réduire ou même bloquer la transcription.
De plus, en utilisant les milieux HAN nouvellement décrits, nous pourrions réduire considérablement le temps de formation des colonies pour une récupération mutante. La première étape consiste à définir le protospacer qui sera contenu dans l’ARN guide. Cette séquence comprend 20 nucléotides qui définiront l’appariement de base aux cibles génétiques souhaitées.
Soumettez une séquence nucléotidique au serveur Web CHOPCHOP, avec des paramètres définis pour streptococcus pyogenes, Cas9, et protospacer motif adjacent, NGG. En fonction des résultats, sélectionnez les protospacers avec les meilleurs scores dans la tendance moins. Le motif NGG ne sera pas inclus dans la séquence finale.
Nous avons utilisé le promoteur lipL32 pour exprimer l’ARN monoguide, qui contiendra les nucléotides variables 20 à cinq premiers à un échafaudage dCas9 conservé. Après avoir obtenu la cassette, il sera relégué dans le PMaOri. Plasmide dCas9 au site de restriction de Noma1.
Pour la conjugaison, les cellules leptospira sont cultivées à 29 ou 37 degrés Celsius dans les milieux HAN. Un jour avant une conjugaison, des cellules égalisées de distributeur sont cultivées dans des milieux de LB complétés avec de l’acide diaminopimelic, le DAP, et le spectinomycin. Ensuite, dans la journée de conjugaison griller les cultures saturées D.coli dans LB plus DAP.
À l’intérieur d’une hotte de biosécurité, assemblé l’appareil de filtration en plaçant le filtre à membrane sur le dessus de la base en verre, suivi d’un entonnoir en verre de 15 ML. Les deux pièces sont maintenues ensemble par cette pince à ressort. Ensuite, connectez le verre à une pompe à vide, ajoutez cinq ML de cultures de leptospira à l’entonnoir.
Ensuite, ajoutez la souche E.Coli beta 2163 contenant le plasmide d’intérêt. Le volume variera en fonction de la densité optique de la culture. Nous visons la pipersion cellulaire un-à-un.
Tournez la pompe à vide, maintenant les liquides, nous allons passer à travers la membrane et les cellules seront concentrées sur le dessus. Prenez le filtre et placez-le sur la plaque EMJH plus DAP, côté bicurier vers le haut. Incuber les plaques à 29 degrés Celsius pendant 24 heures.
Ensuite, récupérez les filtres des plaques et placez-les dans un tube conique de 50 ML. Utilisez un ML de média HAN liquide pour récupérer les cellules du filtre par pipetage. Visualisez les cellules récupérées par microscopie à champ sombre.
À ce stade, on peut voir des nombres équivalents d’E. coli et de leptospiras. 100 à 200 microlitres sont utilisés pour répandre la bactérie sur les plaques HAN contenant de la spectinomycine. À ce stade, le DAP est omis et E. coli ne se développera pas.
Les plaques sont incubées à 37 degrés Celsius et 3% de CO2. Les colonies doivent être apparentes entre huit et 10 jours. Les colonies de Leptospira interrogans sont un peu difficiles à visualiser.
Ici, nous montrons des colonies envahies par la prolifération pour faciliter leur vue. Ajouter 100 microlitres de HAN liquide, à 1,5 ML tubes pour récupérer les mutants. Il est recommandé de prendre au moins trois colonies de chaque plaque.
À l’aide d’une pointe de pipette, les colonies individuelles seront récupérées à partir des plaques. Agger devrait être pris seul. Les colonies doivent être prélevées sur des plaques de contrôle contenant du MTP PMaOri.
Plasmide dCas9. Et des plaques avec des leptospiras contenant du plasmide avec à la fois dCas9 et de l’ARN guide conçu pour le gène cible. Les cellules récupérées peuvent maintenant être visualisées sous la microscopie de champ foncé pour confirmer la présence de leptospiras viables de laisser.
Après visualisation des leptospiras de congé, transférer des cellules à des milieux liquides de HAN contenant de la spectinomycine. Après la croissance de culture, des cellules peuvent maintenant être récupérées pour la confirmation de silence et l’évaluation de phénotype. Si des anticorps contre les protéines cibles sont disponibles, l’immunoblot est une méthodologie simple pour évaluer le silence.
Leptospiras contenant pMAOri. dCas9 seul, ou avec l’ARN guide Cas sont évalués par PCR, apprêts flanquant le bois. Le plasmide DMT se traduira par une bande d’environ 300 paires de bases et un seul type d’environ 700 est atteint lorsque la cassette d’ARN guide est présente.
Les immunoblots utilisant des extraits de cellules entières sont réalisés pour faire taire la confirmation, l’expression de la protéine lipL32 est supprimée dans les cellules contenant des plasmides exprimés en dCas9 et guide l’ARN ciblant ce gène. Et les deux lien a et lien B sont absents dans les cellules contenant l’ARN guide, est spécifique pour les deux gènes. Le contrôle lipL41 peut être vu dans toutes les voies.
Nous avons donc utilisé l’interférence CRISPR sur leptospira interrogans, nous l’avons également utilisée sur plusieurs espèces pathogènes supplémentaires de leptospira. Nous l’avons utilisé pour faire taire des gènes spécifiques, ainsi que pour faire taire l’expression de petits ARN non codants. Notre intérêt de recherche est de comprendre les mécanismes pathogènes de l’infection, donc nous cherchons généralement à identifier les facteurs de variance, mais évidemment vous pouvez faire taire votre propre gène de choix et selon votre propre domaine de recherche.
Et par exemple, cela pourrait être la motilité ou la compréhension de la façon dont les leptospiras persistent dans l’environnement, ou le métabolisme. Dans tous les cas, vous devriez être en mesure de générer un mutant spécifique qui vous permettra d’effectuer une génomique fonctionnelle et de comprendre la signification biologique du gène en question. Donc, de nous tous ici au National Animal Disease Center, nous vous souhaitons la meilleure des chances avec vos recherches.
