Cette méthode pourrait nous aider à répondre à des questions clés liées à l’expression des gènes nous montrant exactement comment la structure de la chromatine influe sur l’expression des gènes et comment l’organisation de la chromatine régule la dynamique transcriptionnelle. Nous avons développé cette technologie parce que nous voulions être en mesure de contrôler l’architecture chromosomique pour permettre la création de boucles de chromatine à longue portée. Tout en même temps ont la capacité d’inverser le contexte chromatine pour restaurer la structure chromosomique endogène.
Cette méthode a été conçue pour la facilité d’utilisation et l’applicabilité large. Nous avons profité d’un dimémerisateur non toxique ainsi que d’espèces orthogonales de dcas9 afin de permettre au système d’être utilisé plus largement. Nous avons développé cette méthode parce que nous voulions être en mesure de répondre à la question de longue date du poulet et de l’œuf de savoir si l’expression des gènes engendre l’architecture chromosomique ou si la structure chromosomique conduit à des changements dans l’expression des gènes.
La conception des séquences d’ARN guide CRISPR et l’entretien des cultures cellulaires sont décrits dans le protocole textuel. Les cartes plasmides et les amorces utilisées y sont répertoriées. Commencez la préparation plasmide en mélangeant cinq microgrammes du plasmide CRISPR lentiviral avec trois microlitres de BsmB1 trois microlitres de phosphatase alcalin six microlitres de tampon de digestion 10x et 0,6 microlitre de 100 millimlaires fraîchement préparés de TNT.
Porter le volume total à 60 microlitres d’eau distillée double et incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour digérer et déphosphorer le plasmide. Ensuite, gel purifier le plasmide digéré dans la boucle plasmide et l’eau distillée double. Ensuite, préparez des réactions d’annealing pour les paires d’ARN de guide.
Combinez un microlitre de chaque ARN guide à 100 micromolaire avec un microlitre de tampon de ligature 10x T4 6,5 microlitres d’eau distillée double et 0,5 microlitre de T4 PNK pour un volume de réaction total de 10 microlitres. Pour anneal le guide ARN paires à leurs séquences cibles incuber les mélanges à 37 degrés Celsius à 30 minutes suivie d’une incubation à 95 degrés Celsius pendant 5 minutes, puis réduire progressivement la température à 25 degrés Celsius en le diminuant de cinq degrés Celsius par minute. Ensuite, diluer le guide annealed ARN à un à deux cents dans l’eau distillée double.
Maintenant, préparez les deux réactions de ligature. Mélanger un microlitre du plasmide digéré avec 0,5 microlitres d’un guide perivaneal dilué RNAse 2,5 microlitres de tampon de ligature 2x un microlitre d’eau distillée double et 0,5 microlitres de ligase. Incuber les réactions à température ambiante pendant 10 minutes pour ligate les guides BsmB1 plasmide digéré.
Transformez ensuite le plasmide nouvellement ligaté en trois bactéries stables et amplifiez les bactéries à l’aide de n’importe quelle méthode de préparation des plasmides. Sur une assiette de six puits, par puits, graine 750 000 2n3 Tcells en DMEM avec 10% de FBS et 1% de streptocoque de stylo. Utilisez un puits pour chaque construction et incuber les cellules pendant 24 heures.
Le lendemain, changer le moyen à l’antibiotique frais sans DMEM avec 10%FBS. Juste après avoir changé le milieu pour chaque puits de cellules plaquées préparer un tube de mélange de production de Lentivirus. Par chaque réaction, diluer 11 microlitres de réagage de transfection lipidique-base avec 150 microlitres du milieu Opti-MEM pour chaque réaction.
Puis dans des tubes séparés préparer l’ADN. Combinez deux microgrammes du plasmide vecteur lentiviral CLOud9 avec deux microgrammes des autres composants d’emballage lentiviral. Diluer ce mélange en 150 microlitres du milieu Opti-MEM.
Ensuite, combinez des volumes égaux du mélange plasmide lentiviral dilué dans le réagent à base de transfection à base de lipides dilué et incuber les mélanges pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, à chaque puits de cellules ajouter un tube des mélanges préparés et continuer l’incubation. 48 heures plus tard, transférer les supports de production virale des puits de plaques en cônes et les faire tourner à 300 g pendant cinq minutes.
Ensuite, transférez le supernatant dans des tubes frais pour jeter les débris granulés. Maintenant, utilisez immédiatement le média de production virale pour transduire les cellules cibles ou les congeler à 80 degrés Celsius pour une utilisation future. Commencez par ajouter 250 microlitres de chaque construction virale d’intérêt, qui dans ce cas, est composée de plasmides CLOud9 complémentaires à un tube conique de 50 millilitres contenant 80 000 cellules.
Ajoutez ensuite suffisamment de Polybrene pour qu’il soit entre un et huit microgrammes par millilitre en solution. Ajustez ensuite le volume total de chaque tube à un millilitre à l’aide d’un média sans antibiotiques. Maintenant, pour augmenter le contact entre les particules virales et les cellules tourner les cellules à 800 g pendant 30 minutes à température ambiante.
Puis re-suspendre les cellules au supernatant par pipetting. Ensuite, chargez la suspension des cellules sur des plaques de culture et incubez-les pendant 24 heures. Le lendemain, recueillir les cellules.
Centrifugez-les à 300 g pendant cinq minutes à température ambiante et suspendez-les dans un milieu normal. Le lendemain, ajouter la puromycine et l’hygromycine au milieu pour sélectionner les cellules doublement transduced. La concentration appropriée d’antibiotiques doit être déterminée à l’avance pour chaque type de cellule.
Ensuite, incuber les cellules dans le média de sélection pendant au moins trois jours avant de procéder à des applications en aval et continuer à maintenir les cellules et les supports de sélection. Pour dimimer les cellules sélectionnées et transduced CLOud9 ajouter un millimolaire ABA au plat de culture. Pour les contrôles, ajouter DMSO, puis maintenir les cellules avec ABA ou DMSO pour la durée de l’expérience.
Pour inverser la dimérisation, lavez les cellules avec suffisamment de PBS pour couvrir la surface de la plaque deux fois. Par la suite, les cellules de culture dans les médias sans ABA pour les maintenir dans un état nonimerized. L’utilisation appropriée du système CLOud9 induit un contact réversible des constructions complémentaires CSA et CSP CLOud9 par l’ajout ou le retrait de l’ABA aux médias de culture cellulaire.
Les constructions de l’ASC et du CSP sont localisées dans les régions génomiques appropriées à l’aide du guide standard CRISPR RNAse. L’immunoprécipitation de chromatine suivie du PCR quantitatif a été utilisée pour assurer la localisation précise dans le ciblage de chaque composant CLOud9. En outre, la coimmunoprecipation avec et sans ABA vérifié CSA et CSP dimérisation en présence du ligand ainsi que la réversibilité en l’absence de ligand.
Après la dimérisation d’ABA, un plus grand contact entre la bêta-globine et le LCR a été mesuré par capture de confirmation de chromosome. Toutefois, cela n’a pas été observé dans les contrôles ne contenant que l’ASC ou seulement la construction du CSP. La création de l’interaction bêta-globine LCR n’a pas complètement éliminé le contact endogène de globine de LCR.
Il n’a ajouté qu’au contact original. L’augmentation des contacts de LCR de bêta-globine a été observée par 72 heures de dimimerisation indépendamment de la région exacte dans le LCR visé ou la région de promoteur de bêta-globine. Enfin, la réversibilité du système a été confirmée avec la capture de confirmation de chromosome après avoir enlevé ABA.
Ceci a eu comme conséquence le renouvellement complet de la confirmation endogène. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de changer les médias et d’ajouter des cellules fraîches dimerized CLOud9 transduced tous les jours. N’oubliez pas de travailler avec le lentivirus peut être extrêmement dangereux et toutes les précautions utilisées à BSL 2 doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
