Les ARN non codants ont souvent de multiples isoformes. Dans les études in vitro de surexpression, il est souvent difficile d’étudier tous ces isoformes exprimés. Cette technique permet aux utilisateurs de tirer l’expression directement du génome et de permettre aux cellules d’exprimer les isoformes endogènes pour un ARN non codant particulier.
Cette technique puissante permet à l’utilisateur de diriger spécifiquement l’expression de n’importe quel gène dans le génome avec fidélité et précision. En concevant des ARN guides vers des gènes spécifiques, on est capable d’utiliser les mécanismes endogènes d’épissage génétique pour exprimer les isoformes naturels dans une cellule donnée. Robert Rankin, post-doc de mon laboratoire, démontrera la procédure.
Pour concevoir la séquence d’ARN guide qui se trouve dans 100 paires de base du site de démarrage transcriptionnel, utilisez des bases de données génétiques telles que BLAT pour vous assurer que l’ARN guide est unique au gène d’intérêt. Stockez l’ARN guide et les plasmides Cas9 désactivés à quatre degrés Celsius. Strier E.coli sur une plaque d’agar de bouillon Luria avec de l’ampicilline et faire croître la bactérie pendant la nuit à 37 degrés Celsius.
Le lendemain, choisissez une colonie et cultivez la bactérie en cinq millilitres de LB avec de l’ampicilline pendant la nuit, secouant vigoureusement le tube dans un incubateur de 37 degrés Celsius. Le lendemain, ajouter deux millilitres de bactéries à 200 millilitres de LB avec de l’ampicilline dans un flacon de deux litres, en secouant vigoureusement le flacon pendant la nuit dans un incubateur de 37 degrés Celsius. Faites tourner les bactéries à 3 724 g pendant 20 minutes et procédez à la purification de l’ADN.
Pour créer le lentivirus contenant dCas9, première couche de 100 millilitres plats de culture tissulaire avec cinq millilitres de 0,01%Poly-L-Lysine et plaque cinq millions de cellules HEK293T par plat en 10 millilitres de dulbecco complète Modified Eagles Medium, préparer ensuite des échantillons de transfection de l’ADN en mélangeant 10 microgrammes d’un vecteur d’ARN guide contenant du LTR ou d’un vecteur Cas9 désactivé contenant du LTR avec des plasmides contenant des composants de virus. Ajouter de l’eau à un volume total de 450 microlitres et filtrer le mélange à l’aide d’une pointe de filtre de 0,2 micron attachée à une seringue. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de dichloride de calcium de 2,5 molaires à chaque échantillon de transfection de l’ADN et mélangez doucement.
Filtrer le mélange calcium-ADN à l’aide d’une pointe de filtre de 0,2 micron fixée à une seringue. Pipette 500 microlitres de 2X HBS dans un tube de polystyrène de cinq millilitres. Ajouter 500 microlitres du mélange calcium-ADN dans le sens de la goutte et doucement vortex.
Incuber à température ambiante pendant trois minutes. Ajoutez un millilitre de la suspension HBS ADN-calcium à chaque plat de culture tissulaire contenant hek293T et incubez-les dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5 % à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le troisième jour, retirer lentement et jeter les médias de la vaisselle.
Lavez soigneusement les cellules avec PBS une fois. Ajouter six millilitres de DMEM complet complété par hepes de 20 millimillons et butyrate de sodium de 10 millimlaires. Puis incuber les cellules dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5% à 37 degrés Celsius pendant cinq à six heures.
Après l’incubation, laver les cellules avec PBS une fois et ajouter cinq millilitres de DMEM complet avec HEPES de 20 millimolaires aux cellules HEK293T. Incuber les cellules dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5% à 37 degrés Celsius pendant 12 heures. Le quatrième jour, recueillir les supernatants cellulaires HEK293T et filtrer le supernatant contenant le virus.
Pour commencer le dénombrement des particules virales, diluez d’abord le concentré de lavage du kit P24 ELISA en ajoutant 19 parties d’eau distillée et déionisée. Ensuite, diluer le contrôle positif de ce kit à 200 nanogrammes par millilitre en utilisant RPMI 1640 comme diluant et faire des dilutions pour une courbe standard en tubes de 1,5 millilitre selon le tableau de dilution P24 ELISA. Pour mesurer la concentration du virus dans les échantillons, ajouter les dilutions de l’échantillon aux puits désignés d’une plaque de 96 puits, à partir de 1:1000 dilution et modifier le volume au besoin afin d’être dans la fourchette de la courbe standard.
Ensuite, diluer les échantillons avec Triton X-100 à une concentration finale de 0,5% et ajouter 200 microlitres de chaque échantillon et RPMI 1640 aux puits désignés. Sceller la plaque et l’incuber à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Lavez la plaque avec 300 microlitres par puits du tampon de lavage 1X six fois.
Retirez tout excès de liquide en inversant la plaque et en la tapant sur une serviette en papier. Ajouter ensuite 100 microlitres d’anticorps détecteur du kit à tous les puits sauf le substrat vide. Sceller la plaque et l’incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure.
Lavez la plaque, puis retirez tout excès de liquide en inversant la plaque et en la tapant sur une serviette en papier. Afin de mesurer l’anticorps détecteur, diluer la streptavidine peroxidase raifort à 1:100 dilution avec diluant SA-HRP. Bien mélanger le SA-HRP dilué et ajouter 100 microlitres à tous les puits sauf le blanc.
Sceller et incuber la plaque à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, lavez la plaque avec le tampon de lavage 1X et appuyez sur tout excès de liquide. Déposez un comprimé d’orthophénylènediamine dans 11 millilitres du substrat diluant pour faire suffisamment de solution de substrat pour une assiette.
Vortex la solution OPD vigoureusement pour le dissoudre complètement et le protéger de la lumière. Ajouter 100 microlitres de solution de substrat OPD à tous les puits, y compris le vide. À l’aide d’un spectrophotomètre, lisez immédiatement l’absorption à 450 nanomètres.
Répétez 10 fois à intervalles d’une seconde et prenez la mesure moyenne. Resuspendre et la culture Jurkat T-cellules dans un flacon T75 avec une densité d’un million de cellules en cinq millilitres de la réduction du sérum avec du polybrene. Ajoutez ensuite des supports conditionnés par HEK293T contenant un million de particules virales contenant du dCas9.
Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Trois jours après l’infection, faire tourner les cellules à 233 g de temps pendant cinq minutes et les résuspendre en 10 millilitres de DMEM complet complété par de la puromycine. Culture des cellules dans les flacons T75 et les incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.
Tous les trois jours pendant une période de neuf jours, faites tourner les cellules à 233 fois g pendant cinq minutes et remplacez le média par le DMEM complet complété par de la puromycine. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé. Puis, sur une plaque de 96 puits avec des tissus traités par culture tissulaire, ajouter 10 000 cellules dans 100 microlitres du DMEM complet complétés par de la puromycine dans le premier puits.
Faire 1:1 dilutions en série du contenu des puits suivants avec le DMEM complet complété par de la puromycine. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Étendre les cellules clonales en deux plaques de 24 puits, puis plaquer deux millions de cellules par puits d’une plaque de six puits pour trois des clones.
Plaquez les trois autres puits avec des cellules Jurkat non transduced comme contrôles. Enfin, plaquez les cellules dans un flacon T75 et mettez les cellules dans un incubateur de culture cellulaire pendant la nuit. Pour commencer le PCR quantitatif pour mesurer l’expression des gènes, synthétisez d’abord l’ADN complémentaire en ajoutant un microgramme d’ARN, quatre microlitres de tampon de synthèse cDNA, et un microlitre de transcriptase inverse à 250 tubes microlitres, puis ajoutez de l’eau à un volume final de 20 microlitres.
Ensuite, utilisez un cycleur thermique à 42 degrés Celsius pendant 30 minutes et à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes pour inactiver la transcriptase inverse. Diluer l’ADNC avec 60 microlitres d’eau après la synthèse. Exécutez des réactions en chaîne de polymése pour les tubes contenant 0,5 microlitres de chaque amorce avant et arrière à la concentration finale de 10 micromolaires, cinq microlitres de vert SYBR et quatre microlitres de cDNA.
Enfin sélectionnez les cellules Jurkat-dCas9 dans DMEM complétées par Hygromycin B pendant 10 jours. Faites tourner les cellules et changez les médias tous les trois jours. Purifiez RNAse et passez à RT-qPCR.
Dans cette étude, des séquences de gRNA qui étaient dans 10 à 100 paires de base loin du site transcriptionnel de commencement ont été employées pour diriger le complexe cas9-activant au lieu transcriptionnel d’IFNG-AS1, un long ARN non codant lié à la maladie intestinale inflammatoire. Pour permettre la sélection de cellules doubles transduced, un système à deux plasmides a été utilisé pour transduire les exhausteurs dCas9 ou gRNAse en cellules. Ici, les protéines MS2 améliorent la surexpression de l’IFNG-AS1.
Cas9 expression a été confirmée pour les deux clones. Des amorces contre HPRT1 ont été employées pour confirmer la présence de l’ARN dans les cellules non transduced. L’expression d’ARNm a été confirmée en omettant la transcriptase inverse de la réaction de cDNA.
Trois variantes d’épissage d’IFNG-AS1 ont pu être détectées avec des ensembles d’amorce spécifiques à la transcription ou une amorce contre toutes les transcriptions IFNG-AS1 connues. Toutes les courbes de fluorescence étaient exponentielles, le gène d’entretien ménager HPRT1 atteignant la phase exponentielle en un demi-cycle entre les cellules de contrôle et les cellules exprimant l’ARN IFNG-AS1. Les amorces par rapport à toutes les transcriptions IFNG-AS1 connues étaient les plus détectables entre les expériences, avec des mesures de 20 fois plus d’expression IFNG-AS1.
Toutefois, la troisième transcription de l’IFNG-AS1 a montré une augmentation de cinq à dix fois significative des niveaux IFNG-AS1. Pour surexprimer activement le gène désiré, la conception de l’ARN guide à l’étape 2.1 est essentielle au succès du protocole. En outre, la production de particules virales de qualité assurera une expression robuste de vos composants de protocole.
Une fois que le gène désiré est surexprimé, des études fonctionnelles peuvent être effectuées pour étudier les mécanismes génétiques. Dans notre exemple, nous avons choisi d’examiner la production de cytokine suite à la surexpression de notre gène d’intérêt. Cette technique a été initialement développée par le Groupe Griesbach en 2013 et a été largement appliquée et élaborée par d’autres groupes.
Nous étions ravis d’appliquer cette technique à de longs ARN non codés afin d’explorer leurs fonctions spécifiques. Les lentivirus défectueux par réplication doivent être manipulés dans un laboratoire qui a été approuvé pour des travaux viraux. De plus, les lignées cellulaires humaines et les bactéries E.coli sont considérées comme biodangereuses.
Enfin, les plasmides d’ADN recombinants doivent être manipulés par du personnel qualifié.
