Cette recherche a été financée par prix USDA-NIFA 2015-67015-23488 à Roger Cone. Les auteurs remercient Dr Ronald Phelps pour la description des critères de sélection des stocks géniteurs dans la vidéo. Ahmed Elaswad et Karim Khalil tiens à remercier la culture égyptienne et Educational Bureau à Washington DC pour financer leur recherche de doctorat.

Cette expérience a été menée au poisson Genetics Research Unit, E. W. Shell Fisheries Research Center, Université d’Auburn, Alabama. Tous les protocoles expérimentaux utilisés dans cette expérience ont été approuvées par l’Auburn University Institutional Animal Care et le Comité de l’urbanisme (UA-IACUC) avant le début de l’expérience. Une liste du matériel et des fournitures utilisées dans cette expérience se trouvent dans la Table des matières. Voici les étapes et les procédures de préparation et de la microinjection d’embryons unicellulaire barbue tel qu’illustré à la Figure 1.
1. sélection de titres et de frai de géniteurs
<ol><li>Choisissez saine barbue de géniteurs de la souche ou lignée génétique d’intérêt. Femelles et mâles de barbue devraient montrer bon les caractères sexuels secondaires.</li>
	<li>Sélectionner les mâles qui ont une tête large et musclée qui est plus large que le reste de leur corps avec la papille génitale bien développé. Couleur sombre, de cicatrices et de blessures de ces combats territoriaux sont aussi des signes de préparation sexuelle. Sélectionner les femelles qui ont des têtes qui sont moins larges que le reste de leur corps et ont un abdomen mou, palpable, bien équilibré. Pour une précision et d’éviter soulignant le poisson lors de la première manipulation, cesser de nourrir les femelles 2 ou 3 jours avant d’examiner leur état de préparation pour le frai.</li>
	<li>Effectuer des poissons manutention rapidement, mais avec précaution. Pour réduire le stress de la manipulation, effectuez toutes les procédures nécessitant une manipulation femelles tout en maintenant le poisson fraie sacs (maillage de taille 32 mm).</li>
	<li>Juste avant l’injection d’hormones pour induire l’ovulation, mesurer le poids des femelles.</li>
	<li>Accrocher les sacs de reproduction avec des femelles à l’intérieur d’un flux par le biais de réservoir avec écoulement continu de l’eau et l’aération adéquate.</li>
	<li>Conditions d’asepsie, charger l’implanteur qui a une aiguille de 14 G avec 85 µg/kg de l’hormone lutéinisante implant (LHRHa) analogue de l’hormone. Rincez le site d’injection (musculature dorsale) 0,9 % solution saline stérile avant l’injection. Insérez l’implanteur à un angle de 45° et libérer l’implant. Retirer l’aiguille et le coup du site d’injection avec un tampon d’ouate gonflée dans l’éthanol à 70 %.</li>
	<li>Place le sac de frai dans le réservoir afin que le poisson soit totalement immergé dans l’eau 15 à 20 cm sous la surface de l’eau. Une aération adéquate (au-dessus de 5 ppm dissous d’oxygène) et bonne qualité d’eau sont importantes pour l’ovulation des oeufs de haute qualité.</li>
	<li>Prédire le moment de l’ovulation basé sur la température de l’eau à l’aide de la relation de degré-heure (h)35. Temps de réponse de degré-h = temps entre l’injection d’hormones et de l’ovulation (h) * température (° C) de l’eau. Par exemple, pour un temps de réponse de degré-h de 900 à 1 000, une femme est censée frayer à 36-40 h de temps d’injection de l’hormone à 25 ° C. Habituellement, la première vérification des oeufs se faite à environ 36 h après l’injection d’hormones, puis à intervalle de 4 h.</li>
	<li>Pour vérifier l’ovulation, soulevez doucement le sac frai au-dessus de la surface de l’eau pendant que vous cherchez les oeufs qui sont fixées à l’intérieur du sac de frai. Voir au moins 10 oeufs indique cette femelle est ovulation et prêt pour le décapage de la main.</li>
</ol>2. préparation de sperme
NOTE : Sperme peut être préparé quelques h avant l’heure prévue de l’ovulation.
<ol><li>Euthanasier les hommes par un percussion coup sur la tête sans anesthésie, car l’anesthésie peut avoir un effet négatif sur la motilité des spermatozoïdes.</li>
	<li>Recueillir les testicules dans une petite casserole de pesage, supprimer n’importe quel tissu et lavez-les avec 50 mL de sérum physiologique 0,9 % pour enlever le sang, si nécessaire. Testicules bien développées sont blanches avec nombreuses projections villiformes ( Figure 2).</li>
	<li>Déterminer le poids des testicules.</li>
	<li>Pour préparer la solution de sperme pour la fécondation de l’ovule, transférer les testicules vers le centre de la maille 100 cm2 100 µm avec une pincette. Plier le maillage avec les testicules à l’intérieur, écraser les testicules et le sperme de filtre dans un tube de prélèvement de 50 mL. Cela peut être fait en appliquant une pression de testicules à l’intérieur de la maille contre le bord de la douille de la collection via le pouce. Solution saline à 0,9 % permet de laver le sperme de la maille dans le tube de prélèvement. Une solution saline peut ajouter jusqu'à 10 mL/g de testicules.</li>
	<li>Déterminer la concentration des spermatozoïdes, vérifier la motilité et la viabilité. Remarque : La Concentration peut être déterminée en comptant les spermatozoïdes dans un volume connu de dilué de laitance utilisant un hémocytomètre. Alternativement, on peut estimer la densité du sperme en évaluant la densité optique de laitance à l’aide d’un spectrophotomètre. Dans cette méthode, l’absorption à la longueur d’onde de 505 nm est comparée à une Charte de contrôle qui a été préalablement préparée pour l’absorption des différentes concentrations de sperme36. La motilité des spermatozoïdes peut être vérifiée au microscope comme le moment de l’activation des spermatozoïdes jusqu'à cessation de sperme mouvement (appelé durée de motilité)37. La viabilité des spermatozoïdes peut être déterminée par le sperme avec des colorants sélectifs tels que le bleu de trypan qui tache de spermatozoïdes seulement non viables, tandis que les spermatozoïdes viables restera sans tache de coloration. Cependant, à ces opérations de microinjection, ce n’est pas nécessaire si les testicules sont bien développés.</li>
	<li>Stocker le sperme dans une solution saline 0,9 % de l’étape de 2,5 à 4 ° C et utiliser dans les 24h après préparation.</li>
</ol>3. collecte et fécondation des oeufs
<ol><li>Appliquez une très fine couche de matière grasse pour une propre et sèche pan de frai de 20 cm de diamètre.</li>
	<li>Placer la femelle dans la solution anesthésique contenant 100 ppm de méthane-sulfonate de tricaïne tamponnée avec du bicarbonate de sodium (pH de la solution finale doit être 7.0) jusqu'à ce que le poisson soit complètement anesthésiés38. ATTENTION : Méthane-sulfonate de tricaïne peut être irritant, s’il est inhalé, ingéré ou absorbé par la peau.</li>
	<li>Avec précaution, retirez le poisson du sac frai et tremper dans une solution saline de 0,9 % à laver la solution anesthésique. Sécher le poisson complètement à l’aide d’une serviette propre, en évitant la suppression de la couche de mucus sur la surface de corps de poisson.</li>
	<li>Appliquer shortening végétal sur la zone autour de l’évent, y compris les nageoires pelviennes, pour éviter la saisie des œufs pendant le stripping de la main.</li>
	<li>Main la bande les oeufs dans la poêle graissée fraie en appliquant une légère pression aux ovaires. Bons oeufs devraient circuler librement, être de couleur jaune doré et très peu ou aucun amas ou des caillots de sang (Figure 2). Éviter tout contact entre les oeufs et l’eau avant la fécondation, car l’eau peut stimuler la fermeture du micropyle.</li>
	<li>Pour fertiliser les oeufs à la microinjection, transférer 200 à 300 œufs dans un plat graissé de frai. Plante en plastique graissé étiquettes peut être utilisées comme une cuillère pour transférer les oeufs dans la poêle graissée fraie. Ajouter 1 à 2 mL de la solution de sperme (de l’étape 2.5) aux œufs et mélanger doucement. Le ratio des spermatozoïdes à le œuf doit être environ 11 000 spermes/ovules.</li>
	<li>Ajouter eau douce aux œufs pour activer le sperme et les ovules. Ajouter assez d’eau pour couvrir légèrement les œufs. Doucement agiter les oeufs pour 30 s. fécondation survient dans 1 à 2 min. Il est important de fertiliser les oeufs qui sont disposées en une seule couche. Oeufs de silure adhèrent les uns aux autres, compliquant la microinject des couches multiples d’embryons.</li>
	<li>Ajouter plus d’eau douce pour les oeufs fécondés et laisser les oeufs à durcir pendant 10 à 15 min.</li>
	<li>Couvrez la casserole fraie contenant les oeufs non fécondés restants par une serviette humide pour éviter le dessèchement et fertiliser pendant quelques heures. La fécondation peut se faire de manière échelonnée, par exemple, un lot de 200 à 300 oeufs peuvent être fécondés toutes les 30 à 60 minutes afin d’assurer un approvisionnement continu des embryons au stade une cellule pour la microinjection et embryons témoins non injectées. Éviter tout contact entre la serviette humide et les oeufs car les œufs peuvent adhérer à la serviette humide rendant difficile de les enlever. Dans ce protocole, oeufs fécondés dans les 2 – 3 h après le décapage ont été efficacement micro et avait un succès similaire comme œufs fécondés immédiatement après le décapage.</li>
</ol>4. l’aiguille en tirant et chargement
<ol><li>Extraire un verre de borosilicate de 1,0 mm OD capillaire dans 2 aiguilles (Figure 3). Rangez les aiguilles dans une boîte de papier avec un morceau d’éponge dans laquelle plusieurs incisions ont été faites. Pour éviter de casser l’aiguille, le diamètre de l’éponge doit être inférieur à la longueur de la tige de l’aiguille.</li>
	<li>Ouvrir l’extrémité de l’aiguille en brisant un petit morceau de région plus mince de l’aiguille à l’aide d’un objet pointu. Vous pouvez également ouvrir l’aiguille en pinçant au large de la région plus mince de la pointe avec une pince au microscope.</li>
	<li>Préparer la solution d’injection en mélangeant gRNA(s) protéine Cas9. Autres types d’ARN ou protéine peuvent aussi être injectés avec la même procédure. Dans ce protocole, gRNAs ont été conçus pour cibler deux des gènes apparentés immunitaire barbue, gène de molécule (TICAM1) adaptateur contenant du domaine du récepteur toll/interleukine 1 et gène de rhamnose binding lectine (RBL) et préparées selon Shah et al.. avec l’utilisation d’une haute fidélité Taq polymérase32,,39. Les cibles génomiques de gRNAs étaient GGA GGT GAA GCA CGT CGA GGA 3' pour TICAM 1 gène (Figure 4) 5' et 5' GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3' de l’exon 1 du gène RBL avec motif adjacent de protospacer (PAM) séquence soulignée (Figure 6).<ol>
<li>BLAST guide RNA cibles contre le génome de barbue de séquence et choisissent ceux avec aucun hors-cible des sites potentiels.</li>
		<li>Ajouter rouge de phénol à la couleur de la protéine gRNA/Cas9 mélanger à un tiers du volume total.</li>
		<li>Ajuster la concentration finale de protéine gRNA/Cas9 mélange avec de l’eau libre nucléase afin que chaque embryon est injecté avec le 50 nL contenant environ 2,5 ng gRNA et 7,5 ng Cas9 protéine. Incuber le mélange pendant 10 min sur la glace avant utilisation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Avec un microloader, charger 5 à 10 µL du mélange gRNA/Cas9 dans l’aiguille d’injection en insérant le microloader dans la tige de l’aiguille et expulser le mélange lentement tout en rétractant la pointe de microloader (Figure 3). Ne pas emprisonner de bulles d’air à l’intérieur.</li>
	<li>Fixer l’aiguille à l’exploitant une micropipette et assurer un lien étroit, puis visser le support sur le micromanipulateur. Garantir la libre circulation stable. Appliquer une pression de microinjection en ouvrant la bouteille d’azote et en ajustant le régulateur de pression. Remarque : Le volume d’injection peut être affecté par la pression, le diamètre de l’ouverture de l’aiguille et la durée de l’injection. Pour déterminer le volume à injecter, à injecter dans une goutte d’huile minérale sur un hémocytomètre. Si nécessaire, la pression, la durée de l’injection et le diamètre de l’aiguille peut être ajusté pour augmenter ou diminuer le volume de l’injection. Injecter plusieurs fois dans l’huile minérale pour volume cohérent.</li>
</ol>5. la microinjection d’embryons de poisson-chat
<ol><li>Appliquez une très fine couche de matière grasse pour un plat de Pétri propre de 100 mm.</li>
	<li>À l’aide d’une étiquette de plante en plastique graissé, transfert de 50 à 100 oeufs du bac de la fécondation à la boîte de Pétri et recouvrez-les avec la solution de Holtfreter (Table des matières). Aligner les oeufs uns contre les autres en une seule couche. Cet alignement doit maintenir les oeufs en place au cours du processus de microinjection.</li>
	<li>Placez la boîte de Pétri avec les oeufs sur la scène du microscope et maintenez-le avec une seule main. Piquez l’aiguille avec l’autre main (Figure 3) jusqu'à ce qu’il perce le chorion et le jaune dans un seul mouvement fluide. La pointe de l’aiguille doit être aussi proche que possible de la blastodisc avant de livrer le matériel d’injection.<ol>
<li>Appuyer sur la pédale pour livrer le matériel d’injection dans le jaune. Si le blastodisc n’est pas clairement visible, le matériel d’injection peut se propager dans des lieux différents dans le jaune d’oeuf. Pour ce faire, l’aiguille est insérée à l’extrémité du jaune, puis appuyer sur la pédale et en retirant l’aiguille se font simultanément pour diffuser le matériel d’injection à travers différents domaines du jaune. Jusqu'à 50 microseringues peuvent être injectés dans le jaune de barbue d’embryons, cependant, la quantité de protéines gRNA/Cas9 doit être optimisée pour chaque gène obtenir les meilleurs résultats pour mutation embryon et taux de survie32.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retirer l’aiguille en douceur pour éviter d’endommager le œuf. Déplacer la boîte de Pétri pour injecter un autre oeuf avec la même procédure. Éviter tout mouvement de la boîte de Pétri au cours du processus d’injection, car cela pourrait endommager le œuf ou de casser l’aiguille. Retirer les œufs s’est rompues ou endommagés en raison de la microinjection. Injection peut être démarré à 15 – 20 min après la fécondation et continuer aussi longtemps que les embryons sont encore en phase d’une cellule (jusqu'à environ 60 à 90 min après la fécondation).</li>
	<li>Placez les embryons injectées en solution de Holtfreter contenant 10 ppm de doxycycline et continue aération douce pour 6 à 7 jours avant l’éclosion de40. Changez la solution tous les jours et retirer les embryons morts.</li>
</ol>6. détection de mutations
<ol><li>Au hasard, recueillir plusieurs embryons injectées à 72 h après la fécondation, enlevez le jaune et extraire l’ADN génomique. Inclure non injectés de 3 – 5 embryons sous forme de contrôle. Remarque : L’ADN génomique peut être extraites des embryons après enlèvement des coquilles d’oeufs et de matériel de jaune de œuf à l’aide de la digestion de la protéinase K et éthanol précipitation32.</li>
	<li>Amplifier un segment d’ADN flanquant les cibles génomiques pour gRNA de chaque gène, où les mutations sont censées se produire, en utilisant une haute fidélité Taq polymérase32. Pour TICAM 1, les amorces 5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG 3' (avec impatience) et 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (marche arrière) ont été utilisées pour amplifier un 750 bp alors que pour la RBL, les amorces 5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA 3' (avec impatience) et 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (marche arrière) ont été utilisées pour amplifier un segment bp 375 du gène de la RBL.<ol>
<li>Utiliser la réaction PCR : jusqu'à 20 µL PCR l’eau de qualité ; 1 x haute fidélité tampon de réaction enzyme Taq avec MgCl2, dNTP 0,2 mM mix, 0,4 µM pour chacun de l’apprêt avant et arrière de la même série, 100-300 ng ADN génomique et 1,25 unité de mélange d’enzyme Taq haute fidélité. Effectuer des conditions cyclisme d’amplification : dénaturation initiale à 94 ° C pendant 3 min ; 35 cycles de dénaturation à 94 ° C pendant 30 s, recuit à 60 ° C pendant 55 s pour TICAM et 40 s pour RBL, extension à 72 ° C pendant 1 min/kb ; et une extension finale à 72 ° C pendant 10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Détecter les embryons mutants à l’aide d’une méthode de détection de mutation comme le séquençage des amplicons purifiées, test de détection de mutation arpenteur, analyse de mobilité hétéroduplex, perte du site de reconnaissance des enzymes de restriction, ou toute autre méthode de détection de mutation qui est approprié pour la cible. Dans ce protocole, détecter les embryons mutants à l’aide de test de détection de mutation arpenteur pour TICAM 1 et perte d’enzyme de restriction que SAPI couper site mais aussi de séquençage des produits PCR purifiés pour le gène de la RBL.</li>
	<li>Afin d’identifier les allèles mutants, cloner des produits PCR et vecteurs de la séquence des colonies individuelles. Les allèles mutants présentés dans la Figure 4 et Figure 6 provenaient d’embryons injectées. Produits PCR de six micro et embryons de 3 témoins pour chaque gène ont été regroupées dans deux tubes séparés, un pour les embryons microinjectés et l’autre pour les embryons de témoins, rapidement clonés et 86 vecteurs pour TICAM 1 et 48 vecteurs de gènes RBL séquencé, dont 8 le séquençage de réactions de 3 embryons de témoins non injectés pour chaque gène.</li>
	<li>Pour identifier les différents allèles mutants, comparer les séquences d’embryons mutants à la séquence de type sauvage à l’aide de n’importe quel outil d’alignement de séquence ADN comme BLAST ou T-café.</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Un protocole détaillé pour microinjection d’embryons de barbue d’atteindre knock-out du gène a été présenté. Injection de la protéine CRISPR/Cas9 dans le jaune d’oeuf est beaucoup plus simple, fait gagner du temps et ne nécessite pas de formation approfondie par rapport à microinjecting le blastodisc de l’embryon unicellulaire, qui est la technique courante pour la plupart de transfert de gène et gène édition avec poisson 30 , 42. le protocol...

Microinjection est une technique courante de laboratoire utilisée pour livrer une petite quantité d’une substance telle que l’ADN, ARN, protéines et autres macromolécules dans des cellules ou des embryons dans un capillaire de verre1. Microinjection est effectuée à l’aide de la configuration d’équipements spéciaux dont un microinjector micromanipulateur et un microscope2. La technique a été utilisée par les chercheurs de modifier génétiquement les nombreux organismes grâce à la génération de transgénèse, débouchures de gènes et thérapie génique, dans le but de comprendre la dynamique des composants intracellulaires3,4 , 5.
La barbue de rivière (Ictalurus punctatus) est l’espèce de poisson-chat plus populaires dans l’aquaculture et les activités de pêche récréative aux États-Unis. Il y a un besoin croissant pour l’étude génomique fonctionnelle chez la barbue et le séquençage du génome complet du barbue améliore l’utilité des progrès récents en génomique édition outils6,7. Comprendre la fonction du gène n’enrichirait pas seulement la recherche qui est actuellement menée sur le poisson-chat, mais pourrait également conduire à des programmes d’amélioration génétique plus efficaces pour améliorer l’industrie du poisson-chat. Une fois que les gènes critiques pour un trait donné d’intérêt sont identifiés, ils peuvent être utilisés pour améliorer génétiquement production poisson-chat par l’édition de génome pour générer des allèles bénéfiques, sélection pour ces allèles, supprimant les allèles préjudiciables, transfert les allèles avantageux grâce à la transgénèse, ou une combinaison de ces options. Combinant les meilleurs gènes pour différents traits commercialement bénéfiques provenant de différentes espèces dans un poisson améliorerait considérablement la productivité et la rentabilité de poisson production opérations8.
Knock-out du gène est une méthode directe pour étudier les fonctions de gènes in vivo. Mutations au niveau de l’ADN seront héritées par les générations futures qui faciliteront l’étude de leurs effets dans les différentes générations. Outils d’édition différents génomes ont été développés notamment zinc finger nucleases (ZFNs), transcription nucléases activator comme effecteur (TAPS) et groupés régulièrement dois‑je court palindrome répétitions/CRISPR-protéine associée à la 9 (CRISPR/Cas9 ) système9,10,11,12.
Le système CRISPR/Cas9 est un outil puissant et efficace qui a été utilisé pour modifier des séquences d’ADN génomique y compris knock-out du gène chez les poissons à guidage RNA DNA in situ clivage5,13. Le système est constitué d’un ARN guide (gRNA), qui détermine la séquence ciblée dans le génome et une enzyme d’endonucléase ADN, Cas9. Le système CRISPR/Cas9 peut être conçu pour cibler n’importe quelle séquence du génome avec plusieurs avantages par rapport aux ZFNs et TALENs : (1) plus bas coût d’ingénierie (2) plus facile fixation (3) plus spécifique du guide RNA de la séquence cible et réduit les mutations hors cible (4) plusieurs séquences peuvent être ciblées avec différent gRNA à la même vitesse de mutagenèse haute heure (5) dans les gènes qui ne pourrait pas être muté par TALENs et (6) taux de transmission meilleure lignée germinale des mutations pour jusqu'à 6 fois par rapport aux ZFNs et TALENs14, 15,16,17,18.
L’autre principale méthode de microinjection est électroporation, dans lequel les impulsions électriques sont appliquées à des embryons ou des cellules pour augmenter la perméabilité de la membrane et l’absorption des molécules biologiques19,20. Plusieurs poissons transgéniques ont été générés en utilisant l’électroporation comme medaka (Oryzias latipes), poisson zèbre (Danio rerio), le saumon chinook (Oncorhynchus tshawytscha), barbue, la dorade (Sparus sarba), et commune la carpe (Cyprinus carpio)21,22,23,24,25,26.
Électroporation a été utilisée pour fournir des protéines ADN, d’ARN et Cas9 de plasmide pour knock-out du gène. Dans les cellules de mammifères, Cas9/gRNA plasmid DNA, Cas9 ARNm/gRNA et des complexes de protéine/gRNA Cas9 ont été livrés à l’aide d’électroporation et les taux de mutagenèse étaient plus élevés utilisant des complexes de protéine/gRNA Cas9 pour la plupart électroporation conditions testées27. Les chordés ascidies (Ciona intestinalis), TALENs exprimant les constructions étaient électroporation dans des oeufs fécondés pour induire la knockout de multiples gènes28. ZFNs exprimant le plasmide constructions étaient électroporation pour assommer l’hormone lutéinisante dans barbue29. Cependant, une fois introduit dans la cellule, des constructions de plasmide devra être transcrit à l’ARN et traduit en protéines fonctionnelles avant qu’ils peuvent cibler la séquence d’ADN désirée, ce qui retarderait probablement le temps de la mutagénèse par rapport à la microinjection d’ARN / protéine. Telle qu’un embryon se développe, mutagenèse retard augmente le mosaïcisme des fondateurs injectées. En outre, l’expression transgénique est peu susceptible d’atteindre le niveau d’expression possible avec microinjection, abaissant l’efficacité de la mutagénèse.
Comme un moyen pour introduire des outils d’édition du génome dans les cellules, microinjection présente plusieurs avantages sur électroporation. Génome, édition de molécules peut être fiable introduit dans des cellules ou des embryons par microinjection30. Moins de matériel injection est nécessaire. Il est facile de déterminer les quantités de matériau injecté. Mutation plus élevée avec faible mosaïcisme chez les poissons du fondateur, les taux peuvent être réalisés qui améliorerait la transmission de la lignée germinale des mutations à F1. Moins de poissons fondateur doivent être analysées pour produire la première génération, en raison du taux de mutation plus élevé. Dans l’électroporation, plus de poisson fondateur doivent être analysées qui augmentera les coûts. Cependant, la survie des embryons de barbue micro est inférieure à électroporation ceux, même si cela peut être surmonté en injectant plus embryons31,32. Barbue de rivière, la survie des embryons de jaune d’oeuf-micro varie de 16 à 55 % selon les gènes ciblés et le dosage de la protéine gRNA/Cas932.
Microinjection régulière des embryons de poisson-chat est techniquement difficile et chronophage, cependant, un protocole de microinjection de protéine CRISPR/Cas9 rapid et efficace est présenté pour les embryons de barbue. Ce protocole requiert moins de temps et expertise, puisque la solution protéique CRISPR/Cas9 est injectée dans le jaune d’un embryons de cellule. Des centaines d’oeufs fécondés peuvent être injectés en 1 h (environ le temps nécessaire à la première division cellulaire se produire). Pour valider le protocole, deux gènes reliés à la susceptibilité de la maladie ont été éliminés barbue, le gène molécule (TICAM1) adaptateur sans frais/interleukine 1 récepteur contenant du domaine et le gène de lectine (RBL) de liaison de rhamnose. 1 TICAM est impliqué dans la voie de signalisation initiée par récepteur toll-like (TLR) 3. Chez la barbue, TICAM 1 a considérablement augmenté suite à un tacle bactérien avec Edwardsiella ictaluri, alors qu’il était diminuée dans le poisson-chat bleu, une espèce résistante à ictaluri E.33. RBL joue un rôle important dans l’infection précoce avec celui de Flavobacterium, l’agent causal de la maladie columnaris, où aiguë et upregulation robuste a été enregistrée chez une souche de barbue columnaris-sensible par rapport à un souche résistante à columnaris34.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="520">
	<tbody>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:136px;">Reproboost implant</td>
			<td style="width:115px;">Center of Marine Biotechnology</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">TRICAINE-S</td>
			<td style="width:115px;">Western Chemical. Inc.</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:136px;">Phenol red</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:99px;">P0290</td>
			<td style="width:171px;">0.5%, sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:136px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:115px;">Olympus</td>
			<td style="width:99px;">213709</td>
			<td style="width:171px;">For visualizing the eggs during microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Microinjector</td>
			<td style="width:115px;">ASI-Applied Scientific Instrumentation&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Model MPPI-3</td>
			<td style="width:171px;">For the delivery of the injection material into the embryos</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:115px;">ASI-Applied Scientific Instrumentation&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Model MM33&#160;</td>
			<td style="width:171px;">For holding and controlling the movement of the injection needle.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Eppendorf Microloader</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:99px;">5242956.003</td>
			<td style="width:171px;">For loading injection solution into microinjection needles.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:136px;">Vertical needle puller</td>
			<td style="width:115px;">David Kopf Instruments</td>
			<td style="width:99px;">Model 720</td>
			<td style="width:171px;">For pulling microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Cas9 protein</td>
			<td style="width:115px;">PNA Bio Inc.&#160;</td>
			<td style="width:99px;">CP01</td>
			<td style="width:171px;">Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Expand High FidelityPLUS PCR System</td>
			<td style="width:115px;">&#160;Roche Diagnostics, USA</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:115px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:136px;">Petri dish</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:99px;">25384-302</td>
			<td style="width:171px;">For holding the embryos during the microinjection.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Crisco</td>
			<td style="width:115px;">The J.M. Smucker Company</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:136px;">Holtfreter`s solution</td>
			<td style="width:115px;">Home Made</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">Doxycycline hyclate USP (monohydrate)</td>
			<td style="width:115px;">Letco Medical</td>
			<td style="width:99px;">690904</td>
			<td style="width:171px;">Antibiotic added to Holtfreter&#39;s solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of crispr/cas9 protein into channel catfish, ictalurus punctatus, embryos for gene editing

Le génome complet de la barbue de rivière, Ictalurus punctatus, a été séquencé, menant à plus grandes possibilités pour l’étude de la fonction du gène barbue. Knock-out du gène a été utilisé pour étudier ces fonctions de gènes in vivo. Le cluster régulièrement entrecoupées de protéine de courtes répétitions/CRISPR palindromique associé 9 (CRISPR/Cas9) système est un outil puissant permettant de modifier les séquences d’ADN génomique pour altérer la fonction du gène. Alors que l’approche traditionnelle a été d’introduire CRISPR/Cas9 ARNm dans des embryons de cellule unique entre la microinjection, cela peut être un processus lent et inefficace dans le poisson-chat. Ici, un protocole détaillé pour microinjection des embryons de barbue avec CRISPR/Cas9 protéine est décrite. Brièvement, œufs et du sperme ont été recueillie et puis artificielle fécondation effectuée. Les œufs fécondés sont transférés à une boîte de Pétri contenant la solution de Holtfreter. Volume d’injection a été étalonné et ensuite guider RNAs/Cas9 ciblant le gène de la molécule (1 TICAM) adaptateur contenant du domaine récepteur péage/interleukine 1 et gène de rhamnose binding lectine (RBL) ont été microinjected dans le jaune d’embryons unicellulaire. Le coup de grâce de gène a réussi comme indels ont été confirmés par le séquençage de l’ADN. Les altérations de séquence de protéine en raison de ces mutations inclus déphasage et tronquée de protéine en raison de codons stop prématurés.

Pour démontrer l’efficacité du protocole microinjection, gRNAs conçus pour cibler le barbue sans frais/interleukine 1 gène du récepteur contenant du domaine adaptateur molécule (TICAM1) et la rhamnose binding lectine (RBL) gène étaient micro.
TICAM 1 Séquençage de l’ADN des vecteurs de colonies individuelles de produits PCR regroupées, clonés a révélé les indel mutations induites dans le g?...

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Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Un protocole de microinjection simple et efficace pour l’édition de gène dans des embryons de barbue en utilisant le système CRISPR/Cas9 est présenté. À ce protocole, le guide des ARN et protéine Cas9 étaient micro dans le jaune d’embryons unicellulaire. Ce protocole a été validé par assommant deux gènes immunitaires de barbue.

Microinjection de protéine CRISPR/Cas9 dans des embryons de barbue de rivière, Ictalurus punctatus, pour Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

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QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the identification and verification of a drug resistance gene in the Apicomplexan parasite Toxoplasma gondii, the method of Quantitative Trait Locus (QTL) mapping using a Whole Genome Sequence (WGS) -based genetic map and the method of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 -based gene editing. The approach of QTL mapping allows one to test if there is a correlation between a genomic region(s) and a phenotype. Two datasets are required to run a QTL scan, a genetic map based on the progeny of a recombinant cross and a quantifiable phenotype assessed in each of the progeny of that cross. These datasets are then formatted to be compatible with R/qtl software that generates a QTL scan to identify significant loci correlated with the phenotype. Although this can greatly narrow the search window of possible candidates, QTLs span regions containing a number of genes from which the causal gene needs to be identified. Having WGS of the progeny was critical to identify the causal drug resistance mutation at the gene level. Once identified, the candidate mutation can be verified by genetic manipulation of drug sensitive parasites. The most facile and efficient method to genetically modify T. gondii is the CRISPR/Cas9 system. This system comprised of just 2 components both encoded on a single plasmid, a single guide RNA (gRNA) containing a 20 bp sequence complementary to the genomic target and the Cas9 endonuclease that generates a double-strand DNA break (DSB) at the target, repair of which allows for insertion or deletion of sequences around the break site. This article provides detailed protocols to use CRISPR/Cas9 based genome editing tools to verify the gene responsible for sinefungin resistance and to construct transgenic parasites.

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Details are presented on how QTL mapping with a whole genome sequence based genetic map can be used to identify a drug resistance gene in Toxoplasma gondii and how this can be verified with the CRISPR/Cas9 system that efficiently edits a genomic target, in this case the drug resistance gene.

Mapping QTL et édition CRISPR / Cas9 pour identifier un gène de résistance aux médicaments<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Recherche

Génétique

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

Génération indépendante et dépendante de la sélection de CRISPR / Cas9-Meded Knockouts dans les cellules de mammifères

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Une méthode Standard pour examiner la mutagénicité sur place en fonction de la Mutation ponctuelle de réparation catalysée par CRISPR/Cas9 et SsODN dans les cellules humaines

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

Perturbation de gène hautement efficace des cellules progénitrices hématopoïétiques murins et humains par CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical regions, is caused by infection with Plasmodium parasites. The development of more effective drugs to combat malaria can be accelerated by improving our understanding of the biology of this complex parasite. Genetic manipulation of these parasites is key to understanding their biology; however, historically the genome of P. falciparum has been difficult to manipulate. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been utilized in malaria parasites, allowing for easier protein tagging, generation of conditional protein knockdowns, and deletion of genes. CRISPR/Cas9 genome editing has proven to be a powerful tool for advancing the field of malaria research. Here, we describe a CRISPR/Cas9 method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in P. falciparum. This method is highly adaptable to other types of genetic manipulations, including protein tagging and gene knockouts.

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

We describe a method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in Plasmodium falciparum using CRISPR/Cas9 genome editing.

CRISPR/Cas9 gène édition à faire conditionnel Mutants de Human Parasite du paludisme à P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

Protéine endogène de marquage dans l’homme induites par les cellules souches pluripotentes à l’aide de CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of CRISPR/Cas9 elements into the target cells by transfection is a prerequisite for efficient gene editing. This protocol demonstrates that tube electroporation (TE) machine-mediated delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), along with single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor templates to different types of mammalian cells, leads to robust precise gene editing events. First, TE was applied to deliver CRISPR/Cas9 RNP and ssODNs to induce disease-causing mutations in the interleukin 2 receptor subunit gamma (IL2RG) gene and sepiapterin reductase (SPR) gene in rabbit fibroblast cells. Precise mutation rates of 3.57%-20% were achieved as determined by bacterial TA cloning sequencing. The same strategy was then used in human iPSCs on several clinically relevant genes including epidermal growth factor receptor (EGFR), myosin binding protein C, cardiac (Mybpc3), and hemoglobin subunit beta (HBB). Consistently, highly precise mutation rates were achieved (11.65%-37.92%) as determined by deep sequencing (DeepSeq). The present work demonstrates that tube electroporation of CRISPR/Cas9 RNP represents an efficient transfection protocol for gene editing in mammalian cells.

Presented here is a protocol for efficient CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated gene editing in mammalian cells using tube electroporation.

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target against T. cruzi, it is important to validate the essentiality of the target gene in the mammalian stage of the parasite, the amastigote. Amastigotes of T. cruzi replicate inside the host cell; thus, it is difficult to conduct a knockout experiment without going through other developmental stages. Recently, our group reported a growth condition in which the amastigote can replicate axenically for up to 10 days without losing its amastigote-like properties. By using this temporal axenic amastigote culture, we successfully introduced gRNAs directly into the Cas9-expressing amastigote to cause gene knockouts and analyzed their phenotypes exclusively in the amastigote stage. In this report, we describe a detailed protocol to produce in vitro derived extracellular amastigotes, and to utilize the axenic culture in a CRISPR/Cas9-mediated knockout experiment. The growth phenotype of knockout amastigotes can be evaluated either by cell counts of the axenic culture, or by replication of intracellular amastigote after host cell invasion. This method bypasses the parasite stage differentiation normally involved in producing a transgenic or a knockout amastigote. Utilization of the temporal axenic amastigote culture has the potential to expand the experimental freedom of stage-specific studies in T. cruzi.

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Here, we describe a protocol to introduce a gene knockout into the extracellular amastigote of Trypanosoma cruzi, using the CRISPR/Cas9 system. The growth phenotype can be followed up either by cell counting of axenic amastigote culture or by proliferation of intracellular amastigotes after host cell invasion.

Présentation d'un Knockout Génique Directement dans la phase Amastigote de Trypanosoma cruzi à l'aide du système CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascoycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to visceral pathology. Deciphering the nature of the vector/parasite interactions is of primary importance for better understanding of Leishmania transmission to their hosts. Among the parameters controlling the sand fly vector competence (i.e. their ability to carry and transmit pathogens), parameters intrinsic to these insects were shown to play a key role. Insect immune response, for example, impacts sand fly vector competence to Leishmania. The study of such parameters has been limited by the lack of methods of gene expression modification adapted for use in these non-model organisms. Gene downregulation by small interfering RNA (siRNA) is possible, but in addition to being technically challenging, the silencing leads to only a partial loss of function, which cannot be transmitted from generation to generation. Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 technology was recently adapted to the Phlebotomus papatasi sand fly. This technique leads to the generation of transmissible mutations in a specifically chosen locus, allowing to study the genes of interest. The CRISPR/Cas9 system relies on the induction of targeted double-strand DNA breaks, later repaired by either Non-Homologous End Joining (NHEJ) or by Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consists of a simple closure of the break and frequently leads to small insertion/deletion events. In contrast, HDR uses the presence of a donor DNA molecule sharing homology with the target DNA as a template for repair. Here, we present a sand fly embryo microinjection method for targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 using NHEJ, which is the only genome modification technique adapted to sand fly vectors to date.

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

This protocol details the steps of CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis in sand flies: embryo collection, injection, insect rearing, and identification as well as selection of mutations of interest.

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microinjection embryonnaire pour CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...