Extraction du cofacteur _F420 pour l’analyse de la longueur de la queue du polyglutamate à partir de cultures pures méthanogènes et d’échantillons environnementaux

Le cofacteur F420 joue un rôle important dans le métabolisme primaire et secondaire de nombreux procaryotes. La mesure de cette molécule dans des échantillons environnementaux permet de mieux comprendre sa prévalence et sa fonction. Cette technique permet l’analyse du cofacteur dans des matériaux d’échantillonnage difficiles tels que les boues et le sol.

Ainsi, la lyse du matériau et la pré-purification avant l’analyse sont les étapes centrales. Le protocole comprend différentes étapes au cours de la préparation de l’échantillon. Ces étapes doivent être très bien planifiées et préparées avant de commencer le traitement de l’échantillon.

Par exemple, la préparation de tampons frais est importante. Pour commencer la lyse de l’échantillon, placez cinq grammes de l’échantillon dans un tube conique de 50 millilitres. Ajoutez ensuite cinq millilitres de tampon de lyse 2X aux échantillons et portez le volume à 10 millilitres avec de l’eau distillée pour atteindre une concentration finale de 0,5 gramme par millilitre.

Vortex les échantillons dilués pendant 20 secondes suivis d’un autoclavage de 30 minutes à 121 degrés Celsius. Pour les échantillons secs comme le sol forestier, porter à un volume final de 20 millilitres avec de l’eau distillée après autoclavage, et vortex l’échantillon dilué à nouveau pendant 20 secondes comme démontré. Une fois les échantillons refroidis, centrifuger le lysat de l’échantillon pendant cinq minutes à 11 000 x g et prélever le surnageant.

Préparez une extraction en phase solide de cinq millilitres ou une colonne SPE remplie de 100 milligrammes de sorbant polymère à mode mixte d’anions faibles conditionnant l’échangeur d’anions avec trois millilitres de méthanol. Ensuite, équilibrez l’échangeur d’anions avec trois millilitres d’eau distillée. Chargez jusqu’à neuf millilitres du surnageant du lysat centrifugé sur la colonne SPE.

Lavez séquentiellement les impuretés de la colonne avec cinq millilitres d’acétate d’ammoniac de 25 millimolaires et cinq millilitres de méthanol. Après le lavage, éluez le cofacteur F420 avec un millilitre de tampon d’élution. Préréglez le four à 40 degrés Celsius et réglez le détecteur de fluorescence sur une longueur d’onde d’extinction de 420 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 470 nanomètres.

Ensuite, filtrez l’échantillon élué du SPE dans des flacons HPLC à l’aide d’un filtre PTFE avec une taille de pores de 0,22 micron. Injectez 50 microlitres de l’échantillon filtré dans le système HPLC et séparez le cofacteur F420 en mode gradient à l’aide d’une combinaison de phases mobiles comme décrit dans le manuscrit. Analyser la composition et la concentration du cofacteur F420.

La croissance de cultures pures de méthanogènes a été vérifiée par microscopie. En microscopie à contraste de phase, des agglomérats de méthanogènes sont visibles, qui émettent une lumière bleutée lorsque le cofacteur F420 est excité par la lumière ultraviolette. La zone de pointe du cofacteur F420 récupéré après SPE avec différents volumes de cultures de Methanoculleus thermophilus a été analysée.

La stratégie de désintégration de l’autoclave a atteint la zone de crête la plus élevée, concluant une efficacité d’extraction maximale à l’aide d’un traitement pression-température. L’analyse de la distribution de la longueur de la queue a révélé les différences dans la concentration globale du cofacteur F420 et la distribution de la longueur de la queue F420 des cultures méthanogènes pures dans les échantillons environnementaux. Lors de l’application de cette procédure, veillez à collecter complètement le volume total du tampon d’élution ou à enregistrer le volume exact de débit.

Cette technique ouvre la voie à l’exploration du cofacteur F420 dans des échantillons plus complexes comme les sols et les boues et permet d’mieux comprendre l’impact écologique de cette molécule.