O cofator F420 desempenha um papel importante no metabolismo primário e secundário de muitos procariotes. Medir essa molécula em amostras ambientais permite uma compreensão mais profunda de sua prevalência e função. Esta técnica permite a análise do cofator em materiais amostrais difíceis, como lodo e solo.
Assim, a lise do material e a pré-purificação antes da análise são as etapas centrais. O protocolo inclui diferentes etapas durante a preparação da amostra. Essas etapas devem ser planejadas e preparadas muito bem antes de iniciar o processamento da amostra.
Por exemplo, a preparação de tampões frescos é importante. Para começar a lise amostral, coloque cinco gramas da amostra em um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, adicione cinco mililitros de tampão de lyse 2X às amostras, e leve o volume a 10 mililitros com água destilada para atingir uma concentração final de 0,5 gramas por mililitro.
Vórtice as amostras diluídas por 20 segundos seguidos de autoclaving por 30 minutos a 121 graus Celsius. Para amostras secas como solo florestal, traga para um volume final de 20 mililitros com água destilada após autoclavação, e vórtice a amostra diluída novamente por 20 segundos, como demonstrado. Uma vez que as amostras esfriem, centrifute a amostra lysate por cinco minutos a 11.000 x g, e colete o supernante.
Prepare uma extração de cinco mililitros de fase sólida ou coluna SPE preenchida com 100 miligramas de ânion misto de ânion misto sorbent condicionando o trocador de ânion com três mililitros de metanol. Em seguida, equilibre o trocador de ânion com três mililitros de água destilada. Carregue até nove mililitros do supernacido do lysate centrifusado na coluna SPE.
Lavar sequencialmente as impurezas da coluna com cinco mililitros de acetato de amônia de 25 mililitros e cinco mililitros de metanol. Após a lavagem, elute o cofactor F420 com um mililitro de tampão de eluição. Predefinir o forno a 40 graus Celsius, e definir o detector de fluorescência para 420 nanômetros de comprimento de onda de extinção e 470 nanômetros de comprimento de onda de emissão.
Em seguida, filtre a amostra elucida da SPE em frascos HPLC usando um filtro PTFE com um tamanho de poro de 0,22 míclico. Injete 50 microliters da amostra filtrada no sistema HPLC e separe o cofator F420 através do modo gradiente usando uma combinação de fases móveis como descrito no manuscrito. Analise a composição e concentração do cofato F420.
O crescimento de culturas puras de methanogênios foi verificado por microscopia. Em microscopia de contraste de fase, aglomerações de antanogênicos são visíveis, que emitem uma luz azulada quando o cofator F420 é animado com luz ultravioleta. A área de pico do cofato recuperado F420 após a SPE com diferentes volumes das culturas termofílicos de Methanoculleus foi analisada.
A estratégia de desintegração autoclavante alcançou a área de pico mais alta, concluindo a máxima eficiência de extração usando um tratamento de pressão-temperatura. A análise da distribuição do comprimento da cauda revelou as diferenças na concentração global do cofator F420 e na distribuição do comprimento da cauda F420 das culturas puras de metogenia em amostras ambientais. Ao aplicar este procedimento, esteja ciente de coletar completamente o volume total do buffer de eluição ou registrar o volume exato de fluxo..
Esta técnica abre caminho para a exploração do cofato F420 em amostras mais complexas, como solos e lodo e permite insights mais profundos sobre o impacto ecológico desta molécula.
