補因子F420は、多くの原核生物の一次および二次代謝において重要な役割を果たす。環境試料の中でこの分子を測定することで、その有病率と機能を深く理解することができます。この技術は、汚泥や土壌などの難しいサンプル材料における補因子の分析を可能にする。
それによって、分析前の材料のリシスおよび予精製が中心的なステップである。このプロトコルには、サンプルの準備中にさまざまな手順が含まれています。これらのステップは、サンプル処理を開始する前に、非常に適切に計画および準備する必要があります。
例えば、新鮮なバッファーの調製は重要です。サンプルのライシスを開始するには、50ミリリットルの円錐管にサンプル5グラムを入れる。その後、サンプルに2Xリシスバッファーの5ミリリットルを追加し、1ミリリットル当たり0.5グラムの最終的な濃度に達するために蒸留水で10ミリリットルにボリュームを持って来ます。
希釈したサンプルを20秒間渦液化し、続いて摂氏121度で30分間オートクレーブする。森林土壌のような乾燥サンプルの場合は、オートクレーブ処理後に蒸留水で20ミリリットルの最終体積を持ち、実証したように希釈したサンプルを再び20秒間渦巻きます。サンプルが冷めたら、サンプルを11,000 x gで5分間遠心分離し、上清を収集します。
5ミリリットルの固相抽出またはSPEカラムを調製し、弱いアニオン混合モードポリマー吸着剤を100ミリグラム充填し、3ミリリットルのメタノールでアニオン交換器を調整します。次に、3ミリリットルの蒸留水でアニオン交換器を平衡化する。遠心分離したライセートからSPEカラムに上清の9ミリリットルまでロードします。
25ミリモルアンモニアアセテートと5ミリリットルのメタノールでカラムから不純物を順次洗浄します。洗浄後、1ミリリットルの溶出バッファーで補因子F420を溶出する。オーブンを摂氏40度にプリセットし、蛍光検出器を420ナノメートルの絶滅波長と470ナノメートルの発光波長に設定します。
次に、0.22ミクロンの孔径のPTFEフィルタを使用して、SPEからHPLCバイアルに溶出したサンプルをフィルタリングします。フィルタリングされたサンプルの50マイクロリットルをHPLCシステムに注入し、原稿に記載されているように移動相の組み合わせを使用して勾配モードで補因子F420を分離する。補因子F420組成と濃度を分析します。
メサノゲンの純粋な培養物の成長は顕微鏡で検証された。位相対面顕微鏡では、メタノゲンの凝集体が目に見え、補因子F420が紫外線で励起されると青みがかった光を発する。異なる量のメサノカレウス熱球培養物を有するSPE後の回収補因子F420のピーク領域を分析した。
オートクレーブ崩壊戦略は、最高のピーク面積を達成し、圧力温度処理を使用して最大抽出効率を達成しました。尾長分布の分析は、環境試料中の純粋なメタノジェニック培養物の補因子F420の全体的な濃度とF420尾の長さの分布の違いを明らかにした。この手順を適用する場合は、溶出バッファーの総体積を完全に収集するか、フロースルーの正確なボリュームを記録することに注意してください。
この技術は、土壌や汚泥のようなより複雑なサンプルで補因子F420の探査への道を開き、この分子の生態学的影響に関するより深い洞察を可能にする。
