הפקת קופקטור _F420 לניתוח אורך זנב פוליגלוטאמט מתרבויות טהורות מתנוגניות ודגימות סביבתיות

F420 קופקטור ממלא תפקיד חשוב בחילוף החומרים העיקרי והמשני של פרוקריוטים רבים. מדידת מולקולה זו בדגימות סביבתיות מאפשרת הבנה עמוקה יותר של שכיחותה ותפקודה. טכניקה זו מאפשרת ניתוח של קופקטור בחומרי מדגם קשים כגון בוצה ואדמה.

ובכך התמוגה של החומר וטיהור מראש לפני הניתוח הם הצעדים המרכזיים. הפרוטוקול כולל שלבים שונים במהלך הכנת המדגם. שלבים אלה חייבים להיות מתוכננים ומוכנים היטב לפני שמתחילים בעיבוד לדוגמה.

לדוגמה, הכנת מאגרים טריים חשובה. כדי להתחיל את תמיסת המדגם, למקם חמישה גרם של המדגם בצינור חרוט 50 מיליליטר. לאחר מכן להוסיף חמישה מיליליטר של 2X חיץ תמה לדגימות, ולהביא את הנפח ל 10 מיליליטר עם מים מזוקקים כדי להגיע לריכוז הסופי של 0.5 גרם למיליליטר.

מערבולת הדגימות המדוללות במשך 20 שניות ואחריהן פירוק אוטומטי במשך 30 דקות ב-121 מעלות צלזיוס. עבור דגימות יבשות כמו אדמת יער, להביא לנפח סופי של 20 מיליליטר עם מים מזוקקים לאחר autoclaving, ואת מערבולת המדגם המדולל שוב במשך 20 שניות כפי שהוכח. ברגע שהדגימות מתקררות, צנטריפוגות הדגימה ליסאט במשך חמש דקות ב 11, 000 x g, ולאסוף את supernatant.

הכן מיצוי שלב מוצק חמישה מיליליטר או עמוד SPE מלא 100 מיליגרם של אניון חלש במצב מעורב סורבט סורבט במצב מעורב מיזוג מחליף אניון עם שלושה מיליליטר של מתנול. לאחר מכן, ישיחל את מחליף האניון עם שלושה מיליליטר של מים מזוקקים. העמיסו עד תשעה מיליליטרים של הסופר-טבעי מהליסאט הצנטריפוגות אל עמוד ה-SPE.

לשטוף ברצף את זיהומים מן הטור עם חמישה מיליליטר של אצטט אמוניה 25 מילימולר וחמישה מיליליטר של מתנול. לאחר הכביסה, לחמוק F420 קופקטור עם מיליליטר אחד של חוצץ elution. קבעו מראש את התנור ל-40 מעלות צלזיוס, והגדירו את גלאי הפלואורסצנטיות לאורך גל של 420 ננומטר ואורך גל פליטה של 470 ננומטר.

לאחר מכן, סנן את הדגימה הנבהלת מה- SPE לבקבוקונים של HPLC באמצעות מסנן PTFE בגודל נקבובית של 0.22 מיקרון. הזרק 50 מיקרוליטרים של המדגם המסונן למערכת HPLC, והפרד את ה-F420 של קופקטור באמצעות מצב הדרגתי באמצעות שילוב של שלבים ניידים כמתואר בכתב היד. לנתח את קומפוזיציה F420 קופקטור וריכוז.

הצמיחה של תרביות טהורות של מתנוגנים אומתה על ידי מיקרוסקופיה. במיקרוסקופיה של ניגוד פאזה, ניתן לראות אגלומרטים של מתנוגנים, הפולטים אור כחלחל כאשר קופקטור F420 מתרגש מאור אולטרה סגול. אזור השיא של קופקטור התאושש F420 לאחר SPE עם כרכים שונים של תרמופילוס Methanoculleus נותח.

אסטרטגיית התפוררות האוטו-שעבוד השיגה את אזור השיא הגבוה ביותר, והגיעו ליעילות מיצוי מרבית באמצעות טיפול בטמפרטורת לחץ. ניתוח התפלגות אורך הזנב חשף את ההבדלים בריכוז הכולל של קופקטור F420 ואת התפלגות אורך הזנב F420 של תרביות מתנוגניות טהורות בדגימות סביבתיות. בעת החלת הליך זה, שים לב לאסוף לחלוטין את הנפח הכולל של מאגר ההתחמקות או להקליט את הנפח המדויק של זרימה דרך.

טכניקה זו סוללת את הדרך לחקר קופקטור F420 בדגימות מורכבות יותר כמו קרקעות בוצה ומאפשרת תובנות עמוקות יותר על ההשפעה האקולוגית של מולקולה זו.