보조자 F420 많은 prokaryotes의 기본 및 이차 대사에 중요 한 역할을 한다. 환경 샘플에서 이 분자를 측정하면 보급과 기능을 더 깊이 이해할 수 있습니다. 이 기술은 슬러지 및 토양과 같은 어려운 샘플 재료에서 보조 인자의 분석을 가능하게합니다.
따라서 분석 전에 재료의 용해 및 사전 정제는 중심 단계입니다. 프로토콜에는 샘플 준비 중에 다른 단계가 포함됩니다. 이러한 단계는 샘플 처리로 시작하기 전에 매우 잘 계획되고 준비되어야 합니다.
예를 들어, 신선한 버퍼의 준비가 중요합니다. 샘플 용해를 시작하려면 50 밀리리터 원내 튜브에 5 그램의 샘플을 배치하십시오. 그런 다음 샘플에 2X 리시스 버퍼 5밀리리터를 추가하고 증류수로 10밀리리터에 부피를 가져와 밀리리터당 0.5그램의 최종 농도에 도달합니다.
희석된 시료를 20초 동안 소용돌이치며 섭씨 121도에서 30분 동안 오토클레이브를 사용합니다. 삼림 토양과 같은 건조 한 샘플의 경우, 오토클레이브 후 증류수와 20 밀리리터의 최종 볼륨에 가져와, 입증 된 대로 20 초 동안 다시 희석 된 샘플을 소용돌이. 샘플이 식으면 샘플을 11, 000 x g에서 5 분 동안 lysate하고 상체를 수집합니다.
5 밀리리터 고형물 추출 또는 100 밀리그램의 약한 음이온 혼합 모드 폴리머 셔벤트로 채워진 SPE 컬럼을 메탄올 3밀리리터로 음이온 교환기를 조절합니다. 그런 다음, 증류수 3밀리리터로 음상 교환기를 평형화합니다. 원심 분리된 lysate에서 최대 9밀리리터의 상체를 SPE 열에 로드합니다.
25 밀리머 암모니아 아세테이트의 5 밀리리터와 메탄올의 5 밀리리터로 컬럼에서 불순물을 순차적으로 세척합니다. 세척 후, 응력 자 F420을 용출 버퍼 1 밀리리터로 엘테. 오븐을 섭씨 40도로 미리 설정하고 형광 검출기를 420나노미터 소멸 파장 및 470나노미터 방출 파장을 설정합니다.
다음으로, 0.22 미크론의 모공 크기를 가진 PTFE 필터를 사용하여 SPE에서 HPLC 바이알로 용출된 샘플을 필터링합니다. 여과된 샘플 50마이크로리터를 HPLC 시스템에 주입하고 원고에 설명된 바와 같이 이동 단계의 조합을 사용하여 그라데이션 모드를 통해 공동 요소 F420을 분리합니다. 보조 인자 F420 조성 및 농도를 분석합니다.
메탄원의 순수한 배양의 성장은 현미경 검사법에 의해 확인되었다. 위상 대비 현미경 검사법에서는, 메타노겐의 응집체가 보입니다, 공동 요소 F420이 자외선으로 흥분할 때 푸른 빛을 방출합니다. 메탄오쿨뢰류 의 상량의 SPE 후 회수 된 공동 요소 F420의 피크 영역을 분석했다.
오토클레이브 분해 전략은 가장 높은 피크 영역을 달성하여 압력 온도 처리를 사용하여 최대 추출 효율을 결정했습니다. 꼬리 길이 분포의 분석은 환경 샘플에서 순수 메탄생성 배양의 보조 자인 F420의 전반적인 농도와 F420 꼬리 길이의 분포의 차이를 드러냈다. 이 절차를 적용할 때 용출 버퍼의 총 볼륨을 완전히 수집하거나 정확한 흐름 관통 량을 기록하십시오.
이 기술은 토양과 슬러지와 같은 더 복잡한 샘플에서 공동 요소 F420의 탐사를위한 길을 열어이 분자의 생태 적 영향에 대한 깊은 통찰력을 가능하게합니다.
