Cette méthode permet une détection rapide et à haut débit de l’adhérence des bactéries aux cellules hôtes. Par rapport aux méthodes de placage conventionnelles, il réduit le temps pratique nécessaire à la quantification des bactéries adhérentes. Cette technique est automatisée, rapide et très reproductible.
Il est également largement appliqué à la plupart des cellules hôtes. Cette méthode, il y a très simple. Pour le premier essai, les conditions telles que la multiplicité de l’infection, ainsi que le temps de co-incubation de la bactérie hôte doivent être optimisés.
Récoltez d’abord les cultures bactériennes à une phase exponentielle par centrifugation à 13 000 fois G pendant deux minutes à température ambiante. Après avoir lavé la palette de cellules avec un millilitre de PBS, remettez en suspension la palette bactérienne dans un millilitre de PBS. Déterminer les concentrations de suspension bactérienne en mesurant la densité optique à 600 nanomètres.
Ensuite, pour tacher la suspension bactérienne, ajoutez deux microlitres du colorant de coloration vert ou rouge concentré 500 fois dans un millilitre de suspension bactérienne pour diluer le colorant d’un pli. Incuber les cellules à température ambiante pendant 30 minutes avec une rotation douce dans l’obscurité. Après 30 minutes, centrifugez les bactéries colorées à 13 000 fois G pendant deux minutes et remettez la pastille dans un millilitre de PBS.
Prélever les cellules bactériennes colorées par centrifugation à 13 000 fois G pendant deux minutes. Remettez en suspension la pastille dans un millilitre de milieu F12 K frais et mesurez la densité optique de chaque culture à 600 nanomètres. Diluer ultérieurement les cultures aux concentrations souhaitées en fonction de la multiplicité de l’infection et de la concentration sur les cellules hôtes.
Pour le test d’adhérence bactérienne, lavez trois fois les monocouches de cellules A549 précédemment cultivées en ajoutant 100 microlitres de PBS chaud à chaque puits et pipettez doucement de haut en bas. Ensuite, jetez PBS. Alternativement, après avoir ajouté PBS, attendez 10 secondes, puis retirez PBS à l’aide du vide.
Pour déterminer la cinétique de l’association bactérienne, superposez les cellules avec 100 microlitres de concentrations souhaitées de suspension bactérienne avec différentes multiplicités d’infection. Faites tourner les bactéries et incubez les cellules A549 infectées à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant une heure supplémentaire. Éliminez les bactéries non liées en lavant les monocouches cinq fois avec du PBS chaud, comme démontré.
Ensuite, fixez les cellules en ajoutant 100 microlitres de formaldéhyde à 4% dans tous les puits d’une plaque de 96 puits sur la glace. Après 15 minutes, lavez la plaque trois fois avec du PBS pour retirer la solution de fixation. Coloration dans les noyaux avec 50 nanogrammes par millilitre de tache DAPI pendant 10 minutes à température ambiante.
Après avoir lavé les cellules avec du PBS, couvrez les cellules A549 infectées avec 100 microlitres de PBS pour éviter le séchage, puis stockez la plaque à quatre degrés Celsius jusqu’à deux jours dans l’obscurité ou procédez à l’imagerie. Pour maintenir l’intégrité des données, choisissez aléatoirement et manuellement cinq emplacements de chaque puits pour capturer les images à un grossissement de 20 fois. Capturez les images fluorescentes des bactéries sous les canaux GFP, les cellules A549 sous DAPI, et pour les bactéries colorées par le colorant fluorescent rouge, utilisez le canal PE Si cinq.
Définissez les paramètres de la boule roulante pour le lissage et mesurez automatiquement la fonction d’étalement de points de la déconvolution de l’image en fonction de l’objectif d’obtenir une meilleure résolution. Mesurez l’intensité de fluorescence des cellules hôtes et des bactéries. Définissez l’intensité de fluorescence la plus faible des cellules hôtes et des bactéries comme seuils de comptage cellulaire et comptez toutes les bactéries proches d’une cellule hôte à une distance de 15 micromètres en tant que bactéries adhérentes.
Une fois que les cellules ont été comptées à partir de toutes les images automatisées, analysez les lectures critiques, telles que le nombre de cellules hôtes, la taille et la forme des cellules, le nombre total de bactéries et le compte bactérien moyen par cellule hôte, qui est l’indicateur le plus important pour déterminer l’adhérence bactérienne. Après une heure de co-incubation, la souche PAO1 de Pseudomonas aeruginosa a adhéré aux cellules A549 en fonction de la dose. Des résultats similaires ont également été observés lorsque la bactérie à Gram positif listeria monocytogenes et son bacille subtilis de contrôle négatif.
Une image représentative de la segmentation de P aeruginosa adhérente à l’hôte démontre la facilité de compter les cellules bactériennes à l’aide de ce protocole. Les résultats des analyses automatisées comprennent le nombre de bactéries et de cellules hôtes, le nombre moyen de bactéries par cellule hôte et la taille des cellules hôtes et les zones représentant l’état de santé des cellules hôtes, le niveau d’adhérence bactérienne et la cytotoxicité bactérienne. Outre les cellules A549, les HUVEC ont également été testés pour le test d’observance.
Serratia rubidaea et streptococcus agalactiae adhéraient à HUVEC, mais pas aux cellules A549, et ce qui démontre la détection efficace et l’aptitude de plusieurs hôtes à étudier les interactions des bactéries hôtes à l’aide de cette méthode. Les cellules hôtes devraient atteindre environ 90 à 100% de confluence pour minimiser l’adhérence des bactéries indésirables au fond des puits. Cette technique permettra aux chercheurs d’explorer les nouveaux mécanismes, les interactions hôte-ravageur.
