Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de distinguer les protéines d’activités similaires qui ont des rôles différents, selon la localisation dans l’enveloppe, le stroma ou les membranes thylakoid. En général, les individus nouveaux à cette méthode auront du mal, parce qu’ils vont utiliser des plantes qui sont trop vieux, mélanger la feuille trop longtemps, ou ne sera pas assez prudent lors de la re-suspension des granulés de chloroplaste intact, mais fragile. La démonstration visuelle de cette méthode est critique, car le chargement ou la récupération de la fraction du percoll ou dans les étapes de gradient de saccharose sont difficiles à apprendre.
En raison du risque de mélange des gradients et donc de contamination croisée des différentes sous-fractions de chloroplaste. Imen Bouchnak, doctorant de notre laboratoire, et Lucas Moyet, ingénieur en intérieur, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, cultivez des plantes arabidopsis pendant cinq semaines avec un cycle de lumière de 12 heures à 23 degrés Celsius le jour et 18 degrés Celsius la nuit, avec une intensité lumineuse de 150 micromoleurs par mètre carré par seconde.
Le lendemain, pré-peser un bécher de cinq litres, puis le placer sur la glace. Récoltez les feuilles d’arabidopsis, en vous assurant d’éviter de cueillir du sol. Re-peser le bécher et enregistrer le poids des tissus.
Transférer les feuilles récoltées dans une chambre froide. Placez les feuilles dans un mélangeur contenant deux litres de tampon de broyage et homogénéisez-les en les mélangeant à grande vitesse trois fois pour une durée de deux secondes à chaque fois. Placez quatre couches de mousseline et une couche de tex bleu nylon dans une passoire et ce pour filtrer l’homogénéité.
Presser délicatement les feuilles mélangées à l’intérieur de la mousseline et du tex bleu pour extraire tout le liquide. Récupérer le reste du tissu dans la tasse du mélangeur et répéter le processus d’homogénéisation à l’aide d’un tampon de broyage frais. Utilisez quatre à cinq couches de nouvelle mousseline pour filtrer ce nouvel homogénéité dans un nouveau bécher comme décrit précédemment.
Répartir l’extrait de cellules brutes également en six bouteilles de 500 millilitres. Déposer les bouteilles sur la glace. Centrifugeuse les bouteilles réfrigérées à 2070 G et quatre degrés Celsius pendant deux minutes.
Après cela, jeter délicatement le surnatant. Utilisez une pompe à eau pour aspirer tout supernatant restant et garder les granulés, qui contiennent du chloroplaste brut concentré, sur la glace. À l’aide d’une pipette de 10 millilitres, ajouter trois millilitres de milieu de lavage à chaque bouteille, en s’assurant de ne pas utiliser de pointes de pipette fines pour éviter de casser les chloroplastes.
Ensuite, utilisez un pinceau ou une spatule en plastique incurvée pour suspendre doucement les granulés. À l’aide d’une pipette de 10 millilitres, recueillir les chloroplastes re-suspendus dans un seul tube. Inverser doucement le tube pour obtenir une suspension de chloroplaste homogène.
Pour commencer, utilisez une pipette de 10 millileter pour charger lentement six millilitres de la suspension chloroplaste au-dessus de chacun des six gradients de percoll préparés. À l’aide d’un rotor balançant, centrifuger les gradients à 13 300 G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Utilisez une pompe à eau pour aspirer la phase supérieure, qui contient des chloroplastes cassés et des mitochondries intactes.
Ensuite, utilisez une pipette de 10 millilitres pour récupérer les chloroplastes intacts présents dans la phase inférieure, en prenant soin de ne pas aspirer les noyaux et les débris cellulaires trouvés au fond du tube avec les chloroplastes intacts. Diluer la suspension de chloroplaste intacte de trois à quatre fois avec le milieu de lavage. Conservez environ 10 millilitres d’un aliquot de fraction de chloroplaste intacte pour une analyse plus approfondie par SDS-Page et le ballonnement occidental.
Centrifugeuse à 2070 G et quatre degrés Celsius pendant deux minutes. Après cela, jeter délicatement le surnatant. Utilisez une pompe à eau pour aspirer tout supernatant restant et garder la pastille, qui contient des chloroplastes bruts concentrés, sur la glace.
Pour lyse les chloroplastes intacts purifiés, re-suspendre la pastille dans le milieu hypotonique qui contient des inhibiteurs de protéase. Transférer les chloroplastes re-suspendus dans un tube de faucon de 10 millilitres. Préparez le gradient de saccharose tel qu’il est décrit dans le protocole de texte.
À l’aide d’une pompe périssaltique, chargez lentement trois millilitres des chloroplastes lysés au-dessus de chacun des gradients de saccharose pré-formés. Utilisez un tampon moyen hypotonique pour équilibrer les paires de tubes, puis ultra-centrifugeuse le gradient à 70 000 G et quatre degrés Celsius pendant une heure. Prenez un aliquot des protéines stromal solubles à utiliser dans la détermination de la concentration en protéines.
Ensuite, utilisez une pompe à eau pour aspirer la phase supérieure restante du gradient jusqu’à la bande jaune. À l’aide d’une pipette, récupérer la bande jaune, qui est l’enveloppe. Tirez les enveloppes dans un seul tube.
Ensuite, retirez la phase restante du gradient jusqu’à la pastille thylakoid. Suspendre à nouveau les granulés thylakoid dans le tampon de lavage de membrane avec des inhibiteurs de protéase. Diluer la suspension thylakoid et envelopper trois à quatre fois avec le milieu de lavage, en ajustant le volume final à 10 millilitres.
Équilibrez les paires de tubes avec tampon de lavage membranaire et ultra-centrifugeuses à 110 000 G et quatre degrés Celsius pendant une heure. Après cela, utilisez une pompe à eau pour aspirer soigneusement le surnatant. Ajouter environ 100 microlitres de tampon de lavage membranaire à la pastille de l’enveloppe.
Ensuite, aspirez le surnatant du tube thylakoid. Suspendre à nouveau les granulés thylakoïdes en trois millilitres de tampon de lavage membranaire. Conserver les trois sous-compartiments purifiés dans de l’azote liquide pour les utiliser dans d’autres expériences.
Une fois que les fractions membranaires sont récupérées, lavées et concentrées, SDS-Page est utilisée pour quantifier les protéines et analyser la composition des quatre fractions. La protéine la plus abondante du stroma est RBCL, et les résultats représentatifs montrent le résultat attendu, que très peu de la grande sous-unité de cette protéine est contenue les fractions thylakoid et membrane enveloppe. Les protéines complexes de récolte légère sont des composants thylakoid abondants qui devraient à peine contaminer les membranes d’enveloppe.
Enfin, le translocateur phosphate de phosphate en triose n’est visible que dans la fraction de l’enveloppe purifiée, en raison de son fort enrichissement dans la fraction de l’enveloppe par rapport à l’ensemble des extraits de chloroplaste. La contamination croisée des trois sous-compartiments, la réducteur soluble ketol-acide du stroma, l’enveloppe chloroplaste en cuivre ATPase et les protéines complexes de récolte légère des membranes thylakoid peuvent être quantifiées à l’aide de l’analyse de l’immunoblotting et de la spectrométrie de masse. Bien que le stroma ne soit généralement pas contaminé par des fractions d’enveloppe ou de thylakoid, les fractions purifiées d’enveloppe contiennent 3% de protéines thylakoid et jusqu’à 10% de protéines du stroma.
Les thylakoids sont mal contaminés par les protéines du stroma, mais contiennent jusqu’à 3% des protéines de membrane d’enveloppe. Les chloroplastes remplissent de nombreuses fonctions cruciales telles que l’assimilation du carbone, du soufre et de l’azote, ainsi que la synthèse des métabolites essentiels. Afin de déchiffrer de nouveaux mécanismes réglementaires qui contrôlent la physiologie chloroplastique, la définition de la localisation de la surplastie des protéines chloroplastiques est essentielle aux études super ciblées.
Les chloroplastes contiennent plusieurs sous-compartiments. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine du chloroplaste, comme lorsque la protéine chloroplaste spécifique se trouve dans l’organelle. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de mener toutes les étapes d’isolement chloroplaste à quatre degrés pour remettre protéa résister en fractions purifiées.
Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme les approches protéomiques lascare peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires comme la composition et la dynamique du protéome des valeurs plastidiques sous-compartiments. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la physiologie végétale pour explorer de nombreux aspects différents de la biogenèse et de la fonction chloroplastes à l’aide d’une analyse ciblée des protéines candidats identifiées dans les sous-compartiments plastides. N’oubliez pas que travailler avec le mélangeur de volume, l’azote liquide, sur des composés spécifiques comme les inhibiteurs de la protéase, nécessite des soins spéciaux.
Des précautions telles que le port de gants, d’un manteau de laboratoire et de lunettes de sécurité doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
