Isolement de noyaux à partir de reins de souris adultes pour le séquençage de l’ARN mononucléaire

Notre méthode permet de générer et de comprendre les données d’expression génique de tissus complexes au niveau d’une seule cellule. Notre méthode peut être appliquée à pratiquement n’importe quel tissu de la même manière et conduit à des données de haute qualité avec très peu d’artefacts liés au protocole. La Dre Janna Leiz et moi-même du laboratoire Schmidt-Ott présenterons le protocole.

Commencez par placer le rein sur une plaque de dissection à froid et utilisez un scalpel tranchant ou une lame de rasoir pour obtenir une tranche centrale d’un à deux millimètres. Assurez-vous que le morceau de tissu contient tout l’axe corticomédullaire. Utilisez des ciseaux de microdissection et des pinces pour couper soigneusement le cortex des côtés de la pièce centrale.

Dans la pièce de tissu disséquée, les trois segments du cortex, de la moelle externe et de la moelle interne doivent être clairement visibles. Transférer le morceau de rein dans la solution de stabilisation de l’ARN préalablement préparée et incuber pendant 24 heures à quatre degrés Celsius pour éviter la dégradation de l’ARN. Après 24 heures, retirez la solution de stabilisation de l’ARN.

Retirez soigneusement l’excès de solution avec un papier de soie et conservez le tissu à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit utilisé ultérieurement. Prenez le morceau de rein congelé et transférez-le dans une boîte de Petri en polystyrène pré-refroidi de 60 millimètres sur de la glace contenant un millilitre de tampon de lyse des noyaux 1, ou NLB1. Hacher soigneusement les tissus à l’aide d’une lame de rasoir ou d’un scalpel.

Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette d’un millilitre et transférez le tissu haché et le tampon dans le tube de broyeur placé sur de la glace. En vous assurant que toutes les pièces ont été transférées, lavez la boîte de Petri cinq à 10 fois avec le tampon. Déplacez lentement le pilon A 25 fois de haut en bas dans le tube du broyeur sur de la glace pour homogénéiser la suspension.

Passez l’homogénat à travers une passoire de 100 micromètres dans un tube de collecte pré-refroidi de 15 millilitres sur de la glace et lavez le filtre avec un autre millilitre de NLB1. Lavez le tube du broyeur avec un tampon de lyse froid pour les noyaux EZ et jetez le tampon. Transférer l’homogénat dans le tube du broyeur et déplacer lentement le pilon B 15 fois de haut en bas dans le tube du broyeur sur de la glace pour homogénéiser la suspension.

Transférer l’homogénat dans un tube collecteur prérefroidi de 15 millilitres sur de la glace. Lavez le tube du broyeur avec deux millilitres supplémentaires de NLB1 et assurez-vous de transférer tous les fragments de tissu dans le tube de collecte. Incuber l’homogénat pendant cinq minutes sur de la glace pour lyser les cellules.

Passez l’homogénat à travers une passoire de 40 micromètres dans un tube de collecte pré-refroidi de 15 millilitres. Faites tourner le tube collecteur pendant cinq minutes à 500 fois G à quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse avec un rotor à godet oscillant. En attendant, ajoutez une solution d’inhibiteur de la RNase à NLB2.

Retirer le surnageant sans déranger la pastille. Remettez délicatement la pastille en suspension dans quatre millilitres de NLB2. Sous-tendez soigneusement la suspension avec un coussin d’un millilitre de tampon de gradient de saccharose.

Faites tourner la suspension à 500 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse avec un rotor à godet oscillant. Pendant ce temps, ajoutez une solution inhibitrice de RNase au tampon de suspension des noyaux. Après la centrifugation, retirez délicatement le tube collecteur de la centrifugeuse, en veillant à ne pas déranger les deux couches lors de la manipulation du tube de collecte.

Les débris cellulaires peuvent être observés entre les deux couches. Retirez soigneusement le surnageant, en commençant par les débris. Retirer le surnageant restant sans perturber la pastille de noyaux et remettre délicatement la pastille en suspension dans un millilitre de tampon de suspension de noyaux.

Passez l’homogénat à travers une passoire de 20 micromètres dans le tube de collecte de cellules de tri de cinq millilitres prérefroidi activé par fluorescence. Le nombre de gènes a été tracé par rapport au nombre de transcrits définis par des identificateurs moléculaires uniques et colorés par la fraction de lectures mitochondriales pour évaluer la qualité des noyaux isolés. Au total, 20 000 gènes ont été détectés dans 6 000 noyaux avec 1 600 gènes médians et 2 800 identificateurs moléculaires uniques médians par noyau.

Les modèles d’expression génique des marqueurs enrichis en grappes ont été visualisés à l’aide d’un diagramme à points et de groupes de types cellulaires dans un diagramme d’incorporation de voisins stochastiques distribué en t. Le pourcentage de chaque type de cellule a été calculé et utilisé pour déterminer le rapport entre le tubule proximal et les cellules épaisses des membres ascendants. Il est essentiel de travailler à quatre degrés Celsius en tout temps et de déterminer la quantité optimale de tissu lors des essais pour assurer des suspensions de haute qualité et des concentrations optimales.