Ce protocole facile et reproductible a été utilisé avec succès pour isoler des noyaux de haute qualité provenant de foies modèles de souris sains et malades, ainsi que des foies de primates humains et non humains. Cette méthode ne nécessite qu’une petite quantité de tissu congelé. En outre, l’incitation au grade de densité donne une suspension nucléaire très propre avec tous les principaux types de cellules dans le foie préservés dans la préparation nucléaire finale.
Cette méthode d’extraction des noyaux peut être utilisée dans des échantillons de foie humain bio-archivés qui sont stockés dans des biobanques. Commencez l’homogénéisation des tissus en coupant un morceau cube de 2230 milligrammes ou cinq millimètres d’un tissu hépatique placé dans la boîte de Petri sur de la glace sèche à l’aide d’un scalpel pré-refroidi. Transférer immédiatement la boîte de Petri sur de la glace humide et ajouter un millilitre de tampon d’homogénéisation.
À l’aide du scalpel froid, hachez le tissu autant que possible, en lui permettant d’aspirer avec une pointe d’orifice d’un millilitre de large. Recueillir la suspension tissulaire et la transférer dans un homogénéisateur en verre pré-refroidi de deux millilitres. Lavez la boîte de Petri avec 0,521 millilitre supplémentaire de tampon d’homogénéisation et recueillez tous les morceaux de tissu restants tout en gardant le tout sur la glace.
Effectuez lentement et soigneusement cinq coups avec le pilon A lâche sur la glace sans créer de bulles. Assurez-vous que le pilon se déplace soigneusement du haut vers le bas de l’homogénéisateur à chaque coup. Par la suite, effectuez 10 à 15 coups lents avec le pilon B serré sur la glace sans créer de bulles.
Une fois cela fait, filtrez l’homogénat à travers une crépine cellulaire de 50 micromètres tout en le transférant dans un tube pré-refroidi de 1,5 millilitre. Utilisez plus d’un filtre ou tube pour les homogénats contenant une grande quantité d’amas de tissu conjonctif. Rincez l’homogénéisateur et les filtres avec 0,521 millilitre supplémentaire de tampon d’homogénéisation pour bien recueillir tous les homogénats tissulaires avant la centrifugation par gradient de densité.
Pour la centrifugation par gradient de densité, centrifuger l’homogénat filtré dans une centrifugeuse à angle fixe prérefroidie à 1000 G pendant huit minutes à quatre degrés Celsius. Pendant que l’échantillon est centrifugé, préparez un tube de 1,5 millilitre contenant 250 microlitres de dilution à 50% d’iodixanol et un tube de deux millilitres contenant 500 microlitres de dilution d’iodixanol à 29%. Placez les deux tubes sur de la glace.
Ensuite, à partir de la suspension de centrifugeuse, aspirer le surnageant sans déranger la pastille à l’aide d’une pompe à vide. Re-suspendre la pastille dans 250 microlitres de tampon d’homogénéisation à l’aide de l’embout de pipette à orifice d’un millilitre de large. Ensuite, transférez 250 microlitres de la suspension de noyaux dans un tube pré-refroidi de 1,5 millilitre contenant 250 microlitres de 50% d’iodixanol et mélangez-le doucement et soigneusement pour générer une suspension de noyaux d’iodixanol à 25%.
Ensuite, transférez 500 microlitres de la suspension de noyaux d’iodixanol à 25% dans un tube prérefroidi tube de millilitre contenant 500 microlitres de dilution d’iodixanol à 29%. Centrifuger le tube dans une centrifugeuse à godet pivotant pré-refroidie à 12 500 G pendant 20 minutes, la coupure étant désactivée. Juste avant la fin de l’étape de centrifugation, ajoutez les inhibiteurs d’ARN au tampon de stockage des noyaux, ou NSB tout en procédant aux pipelines de séquençage de l’ARN à noyau unique.
Une fois la centrifugation terminée, aspirer le surnageant sans déranger la pastille à l’aide d’une pompe à vide. Remettez doucement la pastille en suspension dans 100 à 300 microlitres de NSB à l’aide de l’embout de la pince à orifice d’un millilitre de large et transférez la suspension des noyaux dans un tube propre prérefroidi de 1,5 millilitre. Compter les noyaux à l’aide d’une solution de bleu de trypan à l’aide d’un hémocytomètre manuel et utiliser immédiatement la suspension de noyaux obtenus pour le test génomique à noyau unique.
Pour le tri cellulaire basé sur la cytométrie en flux, filtrer la suspension de noyaux à travers un filtre de 50 micromètres dans un tube de tri cellulaire activé par fluorescence ou un tube de fax pré-refroidi de cinq millilitres. Utilisez un trieur de cytométrie en flux muni d’une buse de 100 micromètres et chargez le tube de fax sur le trieur avant de prévisualiser l’échantillon. Configurez la stratégie de contrôle pour le tri des noyaux, en commençant par une porte de dispersion en traçant la zone de diffusion vers l’avant par rapport à la zone de diffusion latérale, suivie de la hauteur du canular par rapport à la zone canular, puis de la largeur du canular par rapport à la zone canular.
Visualisez le profil de ploïdie des noyaux sur l’histogramme de la zone canularée. Pour le tri en plaques de 96 ou 384 puits, réglez le délai de gouttelettes et optimisez l’alignement de la plaque à l’aide de la méthode colormétrique. Réglez le refroidissement de l’échantillon et le support de plaque à quatre degrés Celsius avec la rotation de l’échantillon activée à 300 tr / min.
Trier les noyaux simples à une concentration d’échantillon d’environ une fois 10 à cinq noyaux par millilitre avec un débit de 200 à 500 événements par seconde. L’examen microscopique des noyaux extraits des foies congelés a montré que l’étape de centrifugation du gradient de densité facilitait grandement l’élimination des débris cellulaires et tissulaires indésirables. Cette méthodologie a préservé tous les niveaux de ploïdie, ce qui a été validé et quantifié par analyse cytométrique.
Des mesures de haute qualité ont été observées à partir des données obtenues par extraction de noyaux. L’approximation et la projection uniformes représentaient le nombre de numérations dans tous les noyaux et les principaux types de cellules, qui ne peuvent être identifiés avec confiance qu’avec le transcriptome nucléaire et le séquençage relativement peu profond. Cette approche a permis d’étudier les facteurs de transcription spécifiques au foie et les gènes cibles en aval impliqués dans le métabolisme des xénobiotiques.
Le modèle complémentaire de gènes caractéristiques tels que le CYP2E1 percentral et le CYP2F2 périportail a montré que les noyaux extraits conservaient des informations critiques sur le don de foie. La bibliothèque d’expression génique de l’ARN a été séquencée à une profondeur de 44 600 lectures par noyau et la bibliothèque ATAC à une profondeur de 43 500 lectures par noyau. Une analyse pondérée du plus proche voisin effectuée pour de multiples mesures des deux modalités, ARN plus ATAC, à l’aide des paquets Seurat et Signac a permis l’identification et l’annotation des types de cellules hépatiques majeures et mineures sans biais importants dus à la taille des cellules ou à la fragilité nucléaire.
Les régulateurs transcriptionnels en amont et les gènes caractéristiques du don de foie ont également été détectés dans cette méthode. Il est important d’éviter de créer trop de bulles lors de l’homogénéisation du duvet lors du déplacement des pilons de haut en bas, et de respecter le nombre de coups indiqué dans le protocole.
