Il s’agit du premier protocole optimisé pour isoler des noyaux de haute qualité pour des expériences de séquençage de noyaux uniques utilisant des cerveaux congelés de killifish turquoise africain, un modèle vertébré émergent pour la recherche sur le vieillissement. Ce protocole isole les noyaux très doucement, ce qui le distingue des protocoles plus durs optimisés pour d’autres organismes avec des cerveaux plus myélinisés, ce qui entraîne des noyaux dégradés lorsqu’ils sont utilisés chez le killifish. Cette méthode sera essentielle pour nous aider à comprendre le vieillissement cérébral au niveau d’une seule cellule.
Il devrait bien se traduire dans d’autres tissus nécessitant une isolation plus douce des noyaux. Ce protocole est convivial. La tâche la plus exigeante est la centrifugation à gradient pour l’enlèvement des débris, dans laquelle il vaut mieux être lent et précis que rapide et salissant.
Ari Adler et Brian Teefy, technicien de laboratoire de recherche et chercheur postdoctoral du laboratoire Benayoun, feront la démonstration de la procédure. Après avoir disséqué le killifish, décongelez le tissu cérébral congelé sur de la glace pendant 10 minutes et faites rebondir le cerveau dans un millilitre de tampon de lyse de noyaux glacés dans un homogénéisateur de boue de deux millilitres. Pendant la lyse de l’échantillon, gardez l’homogénéisateur sur de la glace et évitez de générer des bulles.
Faire rebondir le tissu comme décrit dans le manuscrit et laisser reposer l’échantillon sur de la glace dans l’homogénéisateur de rebond pendant deux minutes. Ensuite, filtrez l’échantillon à travers un filtre cellulaire de 70 micromètres dans un tube conique de 15 millilitres préenduit de BSA à 5%. Ajouter quatre millilitres de tampon de lavage de noyaux à l’échantillon en pipetant le tampon de lavage sur le filtre cellulaire de 70 micromètres et mélanger en retournant doucement le tube cinq fois.
À l’aide d’un rotor à godet oscillant, centrifuger l’échantillon à 500 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le surnageant en le versant délicatement dans un récipient à déchets liquides. Conserver l’échantillon à la verticale et retirer le tampon de lavage restant à l’aide d’une pipette P1000.
Remettez immédiatement les noyaux en suspension dans un millilitre de tampon de lavage des noyaux avec un embout de pipette P1000 à large alésage. Ensuite, portez l’échantillon à cinq millilitres en ajoutant quatre millilitres de tampon de lavage des noyaux et mélangez comme démontré précédemment. Enduire la cellule par centrifugation.
Jeter le surnageant et remettre les noyaux en suspension dans un millilitre de tampon de lavage des noyaux avec un embout de pipette à large alésage. Maintenant, transférez les noyaux dans un tube de cytométrie de flux. Ajouter 300 microlitres de solution d’élimination des débris à la suspension cellulaire et bien mélanger en pipetant avec une pointe de large alésage jusqu’à ce que le mélange soit homogène.
Tenez le tube à un léger angle et superposez doucement un millilitre de tampon de lavage des noyaux sur la solution de noyaux à l’aide d’une pipette P1000. Centrifuger l’échantillon dans un rotor à godet oscillant à 3000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Jetez complètement les deux phases supérieures à l’aide d’une pipette P1000.
Transférer la couche inférieure dans un tube conique de 15 millilitres prérecouvert de 5% de BSA. Ensuite, portez le volume à 15 millilitres avec le tampon de lavage des noyaux et mélangez en retournant le tube trois fois. Centrifuger le tube à 1000G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius dans un rotor de godet oscillant.
Retirez soigneusement le surnageant et remettez immédiatement la pastille en suspension dans 150 microlitres de tampon de lavage des noyaux à l’aide d’un embout de pipette à large alésage. Passez à un embout de pipette d’alésage standard réglé sur 300 microlitres. Pipeter l’échantillon entier, puis fixer un filtre de 40 micromètres à l’extrémité de la pointe.
Filtrer l’échantillon en expulsant de force l’échantillon à travers le filtre dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre à faible liaison à l’ADN. Dans un tube FACS, remettre en suspension 10 microlitres de l’échantillon de noyaux filtrés dans 90 microlitres du tampon de cytométrie en flux recommandé. Colorer les échantillons avec de l’iodure de propidium à une concentration finale d’un microgramme par millilitre.
Après avoir configuré l’espace de travail comme décrit dans le manuscrit, démarrez le flux en appuyant sur l’icône de lecture dans le coin inférieur droit. Vérifiez s’il y a des bulles d’air ou des amas dans l’échantillon en utilisant la zone de diffusion latérale par rapport au HDRT. Vérifiez également le nuage de points par rapport au nuage de points vers l’avant pour vérifier que les événements s’accumulent dans les limites de la fenêtre.
Pour une vue agrandie, double-cliquez sur la zone de diffusion latérale par rapport au tracé PerCP-Vio700-A. Cliquez sur le bouton dans la barre d’outils supérieure gauche avec une ligne perpendiculaire pour sélectionner une porte quadrant. Ensuite, cliquez n’importe où dans la zone de diffusion latérale par rapport au tracé PerCP-Vio700-A, et les quadrants apparaîtront à l’intérieur du graphique.
Cliquez n’importe où sur les lignes de séparation du quadrant et faites glisser le curseur pour modifier l’emplacement du quadrant. Placez les quadrants de telle sorte que le quadrant supérieur gauche contienne des débris et que le quadrant supérieur droit contienne des noyaux. Cliquez sur l’icône carré, gris, I pour ouvrir la fenêtre des propriétés.
Accédez à l’onglet des fonctions de la région et assurez-vous d’avoir une coche verte à côté de l’élément supérieur, indiquant que le tracé entier est sélectionné. Sous la liste des fonctions, cliquez sur le nombre par microlitre pour produire une coche verte. Cliquez sur OK et chaque quadrant affichera un nombre par métrique de microlitre.
Sélectionnez le nombre et le pourcentage total dans l’onglet Fonctions de la région pour afficher les nombres bruts et les pourcentages si vous le souhaitez. Dessinez une porte polygonale autour de cette population en cliquant sur le bouton polygonal dans la barre d’outils supérieure gauche. Ensuite, cliquez une seule fois et faites glisser la souris pour dessiner un segment linéaire de la porte.
Cliquez à nouveau pour terminer et commencer le suivant, suivi d’un double-clic pour terminer la porte. Cliquez sur la bordure de la porte et faites glisser la souris pour repositionner la porte. Cliquez sur les sommets de la porte pour modifier la forme, et le nombre par microlitre de la population fermée apparaîtra.
Les noyaux sains qui sont apparus comme des noyaux singulet avec des membranes intactes conviennent à l’analyse en aval. Cependant, les noyaux malsains sont caractérisés par des membranes nucléaires endommagées, ce qui entraîne l’agglutination des noyaux et peut contribuer aux signaux de fond dans les applications en aval. Les noyaux sont sous forme singulet et multiplet dans le quadrant supérieur droit, avec des singulets comme nuage d’événements le plus bas, suivis de doublets et de triplets dans l’ordre croissant.
Les débris sont marqués par des événements dans les deux quadrants les plus à gauche dans une préparation de noyaux de faible qualité où l’étape d’enlèvement des débris a été omise. Les débris représentent plus de 40% des événements. Cependant, dans une expérience de haute qualité, les débris représentent moins de 15% de tous les événements.
Il est impératif d’enlever complètement la couche intermédiaire après l’étape de centrifugation par enlèvement des débris pour réduire les noyaux d’ARN de fond contaminants isolés à l’aide de ce protocole peuvent être utilisés pour le séquençage de l’ARN à noyau unique ou le séquençage ATAC pour obtenir des informations transcriptomiques et épigénétiques au niveau de la cellule unique. Cette technique permettra aux chercheurs d’explorer la régulation des gènes du cerveau au niveau unicellulaire chez le killifish turquoise africain, un organisme modèle de vertébrés naturellement éphébré pour la recherche sur le vieillissement.
