Ce protocole a été développé pour fournir une méthode robuste pour la mesure de la bêta-oxydation totale des acides gras mitochondriaux et peroxysomaux dans les hépatocytes primaires de souris. L’utilisation de cellules intactes maintient l’intégrité des organites et les mécanismes de régulation en place. De plus, le dosage des hépatocytes fraîchement isolés minimise les changements dans l’expression des gènes par rapport au foie d’origine.
La chirurgie peut être difficile. Vous devez être confiant, diligent et concentré. Une fois que la canulation est réussie, essayez de vous détendre, mais faites attention et surveillez la qualité de la perfusion.
Pour commencer la procédure, vaporisez généreusement l’abdomen et la poitrine de la souris anesthésiée avec de l’éthanol à 70%. Ensuite, utilisez la pince pour tirer la peau et la paroi abdominale près de la base de l’abdomen et coupez latéralement de chaque côté de la ligne médiane et jusqu’au diaphragme pour exposer les organes. Exposez la veine cave inférieure, ou IVC, en déplaçant les intestins vers le côté droit et en retournant doucement les lobes du foie vers le haut.
Insérez un petit objet cylindrique, tel qu’un capuchon d’aiguille, sous l’arrière de la souris pour incliner légèrement la CIV et faciliter la canulation. Après avoir démarré la pompe avec un tampon à la vitesse la plus basse, insérez l’aiguille dans l’IVC. Ensuite, coupez la veine porte pour soulager la pression et permettre le drainage du sang et des tampons de perfusion.
Avant d’augmenter le débit à sept mL par minute. Perfuser le foie avec un tampon chaud et s’assurer que la ligne insérée dans le tube contenant le tampon un reste continuellement immergée pour éviter d’introduire des bulles d’air. Pendant la perfusion, ajoutez 130 microlitres de solution de collagénase pour en tamponner deux et mélangez par pipetage avec une pipette sérologique.
Au fur et à mesure que le volume dans le tube contenant le tampon un diminue à environ cinq mL, ajoutez lentement cinq mL de tampon deux pour buffer un par pipetage sur le côté du tube. Répétez l’ajout deux fois avant d’ajouter les deux tampons restants au tube. Arrêtez la perfusion lorsqu’environ 5 à 10 mL de tampon deux sont laissés dans le tube.
Ensuite, retirez le foie et transférez-le dans la boîte de culture de 100 mL contenant 20 mL de tampon glacé deux. Sous la hotte à écoulement laminaire, séparez doucement le tissu hépatique à l’aide de ciseaux chirurgicaux et d’une pince à épiler. Ensuite, ajoutez environ 20 mL de tampon M199 glacé à la suspension d’hépatocytes et filtrez-le à travers une passoire cellulaire de 100 microns à l’aide du piston d’une seringue pour favoriser doucement la libération d’hépatocytes supplémentaires à partir des plus gros morceaux de foie.
Lavez la boîte de culture de 100 mL et la passoire cellulaire avec un tampon M199 pour recueillir la suspension cellulaire jusqu’à ce que le tube de collecte soit plein. Ensuite, centrifugez la suspension à 50 x g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Aspirer le surnageant avant de remettre la pastille d’hépatocyte dans 30 mL de M199 froid en tourbillonnant.
Répétez le lavage une fois. Décongeler les solutions d’acide palmitique et d’albumine sérique bovine, ou BSA, avant de préparer le mélange de substrat pour de multiples réactions. Aliquote 13,5 microlitres de solution de BSA par réaction dans un tube de microcentrifugation.
Après avoir réchauffé le tube à 41 degrés Celsius, ajouter un microlitre de la solution d’acide palmitique de 200 mM par réaction. Vortexer vigoureusement le tube avant et pendant l’incubation à 41 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes pour faciliter la formation du complexe soluble acide palmitique-BSA. Pendant ce temps, aliquote 133 microlitres de 1 M d’acide perchlorique qui seront utilisés pour arrêter les réactions dans des tubes de microcentrifugation séparés de 1,5 mL.
Avant de commencer les réactions, aliquote et incuber 485,5 microlitres de tampon M199 par réaction dans un tube à 37 degrés Celsius pour diluer le complexe radioactif BSA-acide palmitique préparé. Ensuite, distribuez 750 microlitres de M199 avec ou sans inhibiteurs dans les tubes à fond rond séparés de 14 mL comme échantillons. Pendant les étapes de lavage des hépatocytes, 10 à 15 minutes avant de commencer les réactions, transférer les tubes dans un bain-marie agité réglé à 37 degrés Celsius à 180 à 200 rotations par minute.
Si la viabilité des hépatocytes est d’au moins 75%, complétez la préparation du mélange de substrat en transférant 0,8 microlitre d’acide palmitique de carbone 14 par réaction au tube de microcentrifugation contenant la solution clarifiée d’acide BSA-palmitique. Vortex avant de retourner le tube au bain-marie à 41 degrés Celsius. Immédiatement après la remise en suspension finale des hépatocytes, transférer 750 microlitres de la suspension hépatocytaire dans chacun des tubes à fond rond de 14 mL dans le bain-marie agité à l’aide d’une pipette d’un mL et vortexer brièvement les tubes à basse vitesse avant de les transférer dans un incubateur, en échelonnant chaque ajout de 30 secondes.
Transférer une aliquote séparée d’hépatocytes dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL pour qu’il tourne à 3000 x g pendant cinq minutes. Retirez le surnageant avant de stocker la pastille à moins 80 degrés Celsius pour mesurer la quantité totale de protéines dans l’échantillon afin de normaliser les résultats. Alors que les hépatocytes sont en pré-incubation à 37 degrés Celsius, ajoutez le complexe radioactif BSA-acide palmitique au milieu chaud pour maintenir à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à commencer les réactions.
Pour commencer les réactions, retirez les hépatocytes du bain-marie et ajoutez 500 microlitres du mélange de substrat aux hépatocytes. Vortex les cellules à basse vitesse pendant cinq secondes avant de retourner au bain-marie pour incuber pendant 15 minutes. Commencez un ensemble de réactions et arrêtez-vous immédiatement pour déterminer la radioactivité de fond.
Transférer et réserver les aliquotes en double de 200 à 250 microlitres du mélange de substrat restant dans des flacons de scintillation de 6 mL pour effectuer le comptage. Pour arrêter les réactions, retirez les hépatocytes du bain-marie pour les remettre en suspension par vortex à une vitesse modérée, puis transférez 400 microlitres de la suspension hépatocytaire dans les tubes microcentrifugeux contenant de l’acide perchlorique. Immédiatement coiffer et vortexer les tubes avant de répéter la séquence pour tous les échantillons, en échelonnant de 30 secondes.
Après avoir fait tourner les tubes de microcentrifugation de 1,5 mL à 13 000 x g pendant 10 minutes, transférer 300 microlitres du surnageant dans un flacon de scintillation de 6 mL et ajouter 4 mL de liquide de scintillation pour compter la radioactivité dans les échantillons et les aliquotes du mélange de substrat dans un compteur de scintillation. Dans l’étude, la perfusion hépatique a donné 30 à 40 millions de cellules par foie, avec une viabilité moyenne de 80%Il a également été observé que l’abaissement de la concentration de glucose dans le groupe à jeun n’avait aucun effet négatif sur le rendement ou la viabilité des hépatocytes. La suspension hépatocytaire, isolée à partir de souris mâles nourries et à jeun, a été testée pour la capacité de bêta-oxydation des acides gras en présence et en l’absence d’étomoxir, un puissant inhibiteur de la CPT1 et de l’oxydation des acides gras mitochondriaux.
Le nombre par minute, ou CPM, associé à la radioactivité de fond varie avec le lot d’acide palmitique. Cependant, le CPM était encore significativement inférieur aux échantillons incubés avec le mélange de substrat. Les hépatocytes isolés chez les souris à jeun montrent une forte augmentation des taux de bêta-oxydation des acides gras mitochondriaux et peroxysomaux.
Les données ont ensuite été étudiées pour déterminer la vitesse à laquelle l’acide palmitique est oxydé dans les hépatocytes isolés des souris nourries et à jeun. Empêchez les bulles d’entrer dans la ligne. Gardez l’aiguille stable pendant la perfusion.
Soyez doux lorsque vous manipulez les hépatocytes. Gardez-les en suspension lors de leur distribution. Les hépatocytes isolés de cette procédure peuvent être utilisés comme suspension pour tester d’autres voies métaboliques, telles que la synthèse des acides gras, ou ils peuvent être plaqués pour des expériences de culture cellulaire.
