Ce protocole fournit une analyse en temps réel de deux voies bioénergétiques majeures: la respiration mitochondriale et la glycolyse dans les tissus rétiniens de souris ex vivo fraîchement disséqués. L’analyse traditionnelle des hippocampes était axée sur les cellules monocouches cultivées, tandis que ce protocole permet aux chercheurs d’étudier l’activité mitochondriale dans les tissus fraîchement disséqués, en particulier la rétine. Cette technique est utilisée pour étudier les activités des mitochondries et les drapeaux de glycolyse dans les rétines de modèles murins de dégénérescence rétinienne héréditaire.
C’est un outil utile à la recherche rétinienne et a également le potentiel d’être appliqué à d’autres types de tissus pour développer des thérapies potentielles. La partie la plus difficile de ce protocole est d’obtenir des disques de perforation de qualité à partir de la rétine de souris fraîchement disséquée, il est donc recommandé que la personne qui effectuera cette technique ait de bonnes compétences en dissection rétinienne. La veille de l’expérience, ouvrez la cassette de la cartouche du capteur et ajoutez un millilitre de milieu d’étalonnage à chaque puits de la plaque utilitaire.
Incuber pendant la nuit dans un incubateur sans dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pour activer les fluorophores. Le jour de l’expérience, préparez le milieu d’essai dans des médicaments composés dilués à partir de stock. Réchauffez le milieu d’essai dans le bain-marie de 37 degrés Celsius.
Configurez le programme d’essai sur la machine comme décrit dans le manuscrit textuel. Ouvrez le couvercle de la cassette contenant des inserts en maille. Pipette huit microlitres du mélange de revêtement à chaque insert de maille, puis utilisez une pointe de pipette pour étaler doucement la gouttelette autour pour répartir le mélange de revêtement également dans tout l’insert de maille.
Fermez la cassette et laissez les inserts en maille incuber à température ambiante pendant au moins 25 minutes pour l’absorption. Après l’incubation, lavez les inserts en maille en pipetant quatre millilitres du milieu d’essai directement sur les inserts. Secouez doucement la cassette pour vous assurer que tous les inserts en maille sont lavés avec le support d’essai.
Pour préparer le poinçon rétinien, énucléez les yeux d’une souris adulte euthanasiée et placez-les dans du PBS glacé dans une boîte de Pétri, puis placez la boîte de Pétri sous un microscope à dissection. À l’aide de microcisseurs, coupez le nerf optique, puis retirez soigneusement les muscles extrarectus attachés à l’extérieur du globe oculaire. À l’aide d’une aiguille de calibre 30, percez un trou au bord de la cornée.
Utilisez ensuite des microscisseurs à dissection fine pour faire une coupe circulaire le long du bord de la cornée. À l’aide de pinces à dissection pointues, retirez la cornée, le cristallin et l’humeur vitrée de la coupe oculaire. Faites plusieurs petites coupures sur la couche sclérale au bord de la coupe oculaire à l’aide de microcissives à dissection fine.
Utilisez deux pinces à dissection pointues pour maintenir le tissu scléral de chaque côté et tirez très soigneusement sur la couche sclérale pour l’enlever de la rétine neurale. Répétez ceci autour de la coupe oculaire jusqu’à ce que toute la sclérotique soit enlevée et qu’une coupe rétinienne intacte soit obtenue. Faites des coupes radiales sur la coupe rétinienne pour l’aplatir et générez plusieurs sections distinctes à l’aide de microcisseurs de dissection.
Ensuite, à l’aide d’un poinçonneur de biopsie d’un millimètre de diamètre, coupez un disque rétinien de chaque section de la coupe rétinienne aplatie. Poinçonner à égale distance de la tête du nerf optique. Transférer les inserts en maille pré-enduits dans la boîte de Petri de dissection à l’aide de pinces.
À l’aide de deux brosses à cils super fines, placez le disque de perforation rétinien au centre de l’insert en maille avec la couche de cellules ganglionnaires vers le bas touchant la maille et la couche de photorécepteurs vers le haut. Pour charger la cartouche du capteur, retirez la cassette de la plaque de la cartouche de capteur hydratée de l’incubateur à 37 degrés Celsius. Après avoir retiré le couvercle du booster hydro, replacez la cartouche du capteur sur la plaque utilitaire.
Chargez le volume souhaité de solutions de composés d’injection dans les orifices appropriés en maintenant l’extrémité de la pipette à un angle de 45 degrés, en insérant l’embout de la pipette à mi-chemin dans un orifice d’injection avec le biseau de la pointe contre la paroi opposée de l’orifice d’injection. Chargez doucement le composé dans chaque port. Chargez la cartouche du capteur dans la machine pour l’étalonnage en cliquant sur le bouton Démarrer pour ouvrir le plateau de la machine.
Placez la cartouche du capteur dans la machine et cliquez sur le bouton Je suis prêt pour lancer l’étalonnage. Chargez le volume souhaité du milieu d’essai dans chaque puits de la plaque de capture des îlots. À l’aide d’une pince, saisissez le bord de l’insert en maille contenant des disques de perforation rétiniens et sortez-le de la boîte de Pétri.
Tapotez légèrement le fond de l’insert en maille sur un tissu absorbant pour éliminer le liquide supplémentaire et le mettre dans le puits de la plaque de capture des îlots. Répétez cette étape jusqu’à ce que tous les inserts de maille avec des poinçons rétiniens soient placés dans la plaque de capture d’îlot remplissant les puits de correction de fond et les puits vierges avec des inserts de maille vides. À l’aide de deux pinces Graefe, appuyez soigneusement et doucement sur le bord de chaque insert en maille, en vous assurant qu’elles sont bien insérées au bas de la plaque de capture des îlots.
Placez la plaque de capture d’îlots chargée dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes pour la réchauffer, puis éjectez la plaque utilitaire une fois l’étalonnage terminé. Remplacez-le par la plaque de capture d’îlots contenant des poinçons rétiniens et reprenez le test en cliquant sur le bouton de la plaque de cellule de charge. Une fois l’exécution terminée, éjectez la cartouche du capteur et la plaque de capture d’îlot contenant des poinçons rétiniens en cliquant sur le bouton d’éjection, puis cliquez sur le bouton Terminé pour que les données soient automatiquement enregistrées en tant que fichier ASYR et que l’écran change automatiquement pour afficher les résultats.
Le test de stress mitochondrial montrant une trace OCR et un test de taux glycolytique montrant à la fois une trace OCR et ECAR ont été effectués à l’aide de disques perforés rétiniens d’un millimètre fraîchement disséqués. Dans le test de stress mitochondrial, Bam15 a été injecté pour découpler le gradient de protons de la production mitochondriale d’ATP, ce qui a entraîné l’augmentation de l’OCR au niveau maximal. La roténone et l’antimycine A ont été injectées pour inhiber la respiration des mitochondries au complexe un et au complexe trois respectivement, entraînant une baisse de l’OCR au niveau minimal.
La différence entre le niveau maximal d’OCR et la dernière mesure du niveau d’OCR basal reflète la capacité de réserve mitochondriale. Dans le test de la vitesse glycolytique, l’injection de roténone et d’antimycine A arrête la respiration mitochondriale et augmente la glycolyse. La glycolyse est saisie en injectant du 2-désoxy-d-glucose, qui entre en concurrence avec le glucose pour la liaison à l’hexokinase, ce qui fait chuter l’ECAR au niveau minimal.
La différence entre le niveau maximal de glyco ECAR dans la dernière mesure du niveau basal de glyco ECAR reflète la capacité de réserve de glycolyse. Pour produire des données fiables, il est essentiel d’obtenir une bonne qualité de disques perforés rétiniens et de limiter le temps total de dissection en 1,5 heure. Après l’expérience, on peut quantifier l’ADN de la teneur en protéines d’un disque rétinien dans un puits et l’utiliser pour normaliser les données sur les hippocampes.
Ce protocole a donc été utilisé pour étudier le développement, le vieillissement et la maladie de la rétine. La préférence tissulaire ou la dépendance à différents substrats combustibles tels que le glucose ou les acides gras a également été analysée.
