Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’énergie, telles que la santé mitochondriale, l’efficacité énergétique et la consommation d’énergie. Le principal avantage de cette technique est que la consommation d’oxygène des mitochondries isolées est mesurée directement. Les résultats n’ont pas besoin d’être corrigés pour d’autres processus métaboliques intracellulaires.
Nous avons d’abord décidé de poursuivre cette méthode chez les bovins laitiers lorsque nous voulions examiner comment l’efficacité mitochondriale influe sur l’efficacité des aliments pour animaux. La démonstration vidéo de cette méthode est critique car les étapes de l’isolement mitochondrial sont difficiles à apprendre parce qu’elles doivent être cohérentes et précises. Dès que possible après que l’échantillon de foie est retiré de la vache laver l’échantillon dans les mitochondries corps d’isolement pour enlever les globules rouges.
À l’aide de ciseaux finement émincer le tissu dans un bécher réfrigéré qui contient suffisamment de supports d’isolement pour garder le tissu humide. Transférer le foie haché dans un flacon de verre de 30 millilitres contenant des mitochondries. Ajouter un pilon de téflon qui a un dégagement de 0,16 millimètre et qui a été incubé dans la glace et homogénéiser l’échantillon de foie à 500 RPM pendant une minute avec quatre coups par minute.
Après cela, transférez l’homogénéate dans un tube contenant des mitochondries et placez-le dans un bécher rempli de glace. Centrifugeuse homogénéiser à 500 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Jeter la pastille et transférer le supernatant dans un tube de centrifugeuse réfrigéré.
Centrifugeuse le supernatant résultant à 10 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour obtenir la pastille mitochondriale. Resuspendez et lavez la pastille en 10 millilitres de mitochondries avec bsa sans acides gras. Puis centrifugeuse à 8, 100 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.
Jetez le supernatant et réutilisez la pastille dans 200 microlitres de supports d’isolement. Placez-le sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi pour la consommation d’oxygène et les analyses cinétiques de fuite de protons. Déterminer la concentration en protéines de la suspension à granulés à l’aide d’un kit d’acide bicinchoninique selon les instructions du fabricant en utilisant BSA comme norme.
Tout d’abord, créer des supports de consommation d’oxygène tels que décrits dans le protocole de texte. Incuber le média de consommation d’oxygène à 30 degrés Celsius. Ensuite, installez la chambre de respiration, la pompe et l’électrode d’oxygène pour le système oxygraphique selon les instructions du fabricant.
Placez ensuite un millilitre de liquide de consommation d’oxygène dans la chambre respiratoire. Ajouter ensuite 0,35 milligramme de protéine mitochondriale à la chambre. Remuer vigoureusement pour s’assurer que la solution devient saturée d’air et maintenir une température de 30 degrés Celsius.
Enregistrez la consommation d’oxygène pendant environ cinq minutes. Lorsque la consommation d’oxygène devient constante représentée par une ligne droite décroissante, enregistrez ceci comme consommation d’oxygène de base. Ajouter 1,25 microlitres d’une solution de rotenone de quatre millimolaires pour inhiber le complexe, puis ajouter cinq microlitres d’une solution de succinate molaire pour atteindre une concentration finale de cinq millimolaires succinate dans la chambre respiratoire.
C’est la consommation d’oxygène de l’état IV. Après cela, ajouter un microlitre d’une solution ADP de 100 millimlaires pour atteindre une concentration finale de 100 micromolaires dans la chambre de respiration. La consommation d’oxygène diminuera pendant environ cinq minutes, puis deviendra une ligne droite.
Enregistrez cette consommation d’oxygène comme l’état III respiration. Calculez le rapport de contrôle respiratoire tel qu’il est décrit dans le protocole textuel. Ensuite, aspirez toutes les solutions hors de la chambre de respiration.
Rincer la chambre plusieurs fois à l’eau doublement déionisée. Tout d’abord, préparer une solution de 80 nanogrammes par millilitre de nigénicine dans l’éthanol limitant la quantité d’éthanol ajoutée à moins d’un microlitre. En outre, préparer une solution de huit microgrammes par oligomycine millilitre dans l’éthanol.
Après avoir soigneusement rinçant la chambre avec de l’eau doublement déionisée, placez un millilitre du support de consommation d’oxygène dans la chambre de respiration et remuez vigoureusement avec une barre magnétique. Ajouter 0,35 milligramme de protéine mitochondriale à la chambre respiratoire. Ajouter une électrode sensible au triphenylphosphonium méthyle à la configuration de la chambre en s’assurant que l’autre extrémité est correctement reliée à un compteur de pH.
Ajouter 1,25 microlitres d’une solution de rotenone de quatre millimolaires pour inhiber le complexe I.Enregistrer la respiration pendant deux à cinq minutes. Enregistrez la valeur de consommation d’oxygène lorsqu’elle devient constante. Ensuite, ajoutez 0,56 microlitres d’une solution oligomycine pour inhiber l’utilisation d’ADP.
Enregistrez la respiration pendant environ deux à cinq minutes. Enregistrez la valeur de consommation d’oxygène lorsqu’elle devient constante. Ajoutez ensuite 0,112 microlitres d’une solution nigérienne de 80 nanogrammes par millilitre pour abolir le gradient de pH à travers la membrane interne mitochondriale.
Enregistrez la respiration pendant deux à cinq minutes et notez la valeur de consommation d’oxygène lorsqu’elle devient constante. Ajouter cinq microlitres de solution de triphenylphosphonium méthyle millimolaire à l’incubation mitochondriale pour commencer à préparer une courbe standard. Répétez cet ajout quatre fois de plus jusqu’à une concentration totale de 2,5.
micromolaire a été ajouté. Après cela, ajouter cinq microlitres d’une solution de succinate molaire à la chambre pour initier la respiration. Enregistrez la respiration jusqu’à ce qu’une trace stable soit atteinte.
Ajoutez ensuite du malonate pour titrer le système tel qu’il est décrit dans le protocole texte. Dans cette étude, la cinétique de fuite de RCR et de proton sont mesurées dans le lait des vaches laitières holstein 70 jours après que les vaches laitières aient été alimentées avec différents niveaux de cuivre, de zinc, et de manganèse pendant 28 jours. La respiration de l’état IV est considérée comme la plus élevée chez les vaches étant donné les faibles niveaux de manganèse, mais elle est la plus faible chez les vaches de contrôle, ce qui indique que le manganèse joue un rôle important dans la réduction de la respiration dépendante des fuites de protons.
L’analyse de la respiration hépatique dépendante des fuites de protons révèle que cette respiration est la plus grande chez les vaches traitées avec un faible manganèse, et la plus faible chez les vaches sous contrôle. Ces résultats confirment que le groupe de manganèse bas a la respiration iv d’état le plus grand tandis que le groupe témoin a le plus bas. Bien que l’efficacité des aliments pour animaux soit plus élevée chez les bouvillons Angus nés de taureaux RFI bas que chez les taureaux RFI élevés, cela ne s’est pas reflété dans le RCR mitochondrial ou la cinétique des fuites de protons.
Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de garder tous les flacons et les bechers sur la glace tout en traitant les mitochondries. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la nutrition laitière pour explorer le rôle de l’efficacité des mitochondries dans l’efficacité des aliments pour animaux et la fonction mitochondriale dans le foie. N’oubliez pas que le travail avec la rotenone peut être dangereux, et des précautions telles que le port de gants, la protection oculaire et l’EPI approprié doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
