Ce protocole montre la méthodologie appropriée pour le tranchage et la coloration des tissus cardiaques et cérébraux. Il fournit également des lignes directrices pour établir des configurations d’éclairage et de caméra et des techniques de photographie pour l’acquisition d’images. Ces méthodes sont particulièrement utiles pour effectuer des mesures dans l’analyse planimétrique d’images dans les tissus de rongeurs, et peuvent être utiles pour la macrophotographie scientifique générale.
Pour commencer, détachez la canule cardiaque de la seringue remplie de solution de Krebs-Henseleit et reliée à une seringue remplie de solution chaude de Krebs-Henseleit contenant 0,1% de bleu de méthylène. Perfuser le cœur de rat avec quatre millilitres de la solution de bleu de méthylène à raison de quatre millilitres par minute. Après avoir déconnecté la canule de la seringue et retiré le cœur de la canule, retirez l’excès de bleu de méthylène en roulant doucement le cœur sur du papier de soie.
Après avoir retiré l’excès de bleu de méthylène, desserrez la ligature autour de l’artère coronaire en ouvrant la pince hémostatique et en retirant le tube en plastique autour de la suture chirurgicale. Ensuite, placez le cœur de rat taché dans une matrice en acier inoxydable pour le tranchage. Coupez les ventricules en tranches de deux millimètres d’épaisseur, en visant six à sept tranches d’un cœur de rat adulte.
Après la coupe, transférer les tranches dans un tube en plastique de 15 millilitres. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de chlorure de triphényltétrazolium à 1% dissous dans le PBS au tube avec les tranches de cœur et incubez pendant 10 minutes au bain-marie à 37 degrés Celsius avec un mélange doux après cinq minutes. Après l’incubation, lavez les tranches de cœur au moins deux à trois fois avec PBS et préparez-vous à la capture d’images.
Après avoir retiré le cerveau, y compris le tronc cérébral, du crâne, placez le cerveau avec son côté ventral vers le haut dans la matrice cérébrale. En fonction du poids des animaux, choisissez la bonne taille de la matrice en acier inoxydable du cerveau. À l’aide de lames, restreignez les parties frontale et caudale du cerveau.
Ensuite, placez les lames partiellement dans les canaux entre la première et la dernière lame. Lorsque toutes les lames sont insérées et disposées en parallèle, appuyez sur toutes les lames avec la paume en même temps pour couper le cerveau en tranches coronales de deux millimètres. Ensuite, saisissez fermement les lames le long des côtés avec deux doigts et retirez-les avec le cerveau tranché de la matrice.
Disposez les tranches de cerveau une par une dans un plateau, en veillant à ce que la surface intérieure de chaque tranche soit toujours tournée vers le haut. Ensuite, versez une solution chaude de chlorure de triphényltétrazolium à 1% et du PBS sur les tranches de cerveau et incubez pendant huit minutes à 37 degrés Celsius dans l’obscurité. Après l’incubation, transférez les tranches de cerveau dans un plateau en plastique bleu pour capturer des images.
Organisez les tranches de cerveau dans l’ordre séquentiel de la partie frontale à la partie caudale et utilisez un scalpel pour séparer les hémisphères dans le plan sagittal. Photographiez les tranches de tissu immédiatement après la coloration. Configurez l’appareil photo de votre choix avec une batterie chargée, une carte mémoire et un objectif fixé sur un support.
En fonction des sources lumineuses disponibles, sélectionnez les paramètres de balance des blancs appropriés ou effectuez l’étalonnage de la température de couleur conformément aux instructions du manuel de l’appareil photo. Immergez complètement les tranches de cœur dans un récipient avec PBS. Disposez les tranches de cerveau dans un plateau sec sans PBS ni autres liquides.
Placez le récipient avec des tranches sous l’appareil photo avec l’objectif macro. Assurez-vous que toutes les tranches s’adaptent parfaitement au champ de vision et sont sur le même plan. Basculez l’appareil photo en mode entièrement manuel, réglez l’ISO 100 et l’ouverture sur F10.
Ajustez la vitesse d’obturation pour une exposition optimale de l’image et assurez-vous que le plan focal de l’appareil photo est parallèle à la surface où se trouve l’échantillon. Après avoir capturé le nombre d’échantillons, faites pivoter le filtre polarisant circulaire jusqu’à ce que les reflets disparaissent, et imagez la tranche de tissu à l’aide d’un déclencheur à distance pour éviter un tremblement de l’appareil photo lorsque l’obturateur est relâché, puis faites pivoter les tranches et capturez des images de l’autre côté. Cette photographie d’une tranche cardiaque colorée au chlorure de méthylène et de triphényle tétrazolium après un infarctus du myocarde contient suffisamment de détails et d’informations sur la couleur pour une analyse planimétrique plus approfondie de la taille de l’infarctus.
La congélation du tissu cardiaque pendant 24 heures affecte l’intégrité et réduit la fonction mitochondriale. Ainsi, la coloration au chlorure de triphényltétrazolium du cœur n’est pas rouge mais rose pâle, et la frontière entre les tissus nécrotiques et viables est floue. Parmi les deux méthodes comparées pour réduire les reflets dans les spécimens, l’immersion est la méthode la plus efficace et produit des images détaillées avec un bon contraste.
Le filtre polarisant est également efficace, cependant, il réduit légèrement la résolution et le microcontraste de l’image. Une image d’une tranche de cœur sans immersion ni filtre contient de nombreux reflets et ne convient pas à une analyse plus approfondie. Dans l’analyse planimétrique, le côté non affecté du cerveau doit être comparé au côté affecté par l’AVC.
Les réglages manuels de l’appareil photo garantissent une exposition et une balance des blancs optimales de toutes les images, permettant une analyse uniforme. Des exemples d’images surexposées et sous-exposées de tranches de cœur sont présentés ici. De plus, des réglages de balance des blancs incorrects entraînent un passage au bleu ou au jaune et au magenta ou au vert dans l’image.
La macrophotographie scientifique nécessite un éclairage contrôlé et une installation d’imagerie appropriée. La méthodologie standardisée garantit des images numériques détaillées de haute qualité. Cette méthode est applicable à toutes les photographies expérimentales d’organes de petits animaux.
