Ce protocole est un moyen très simple et efficace de détecter les mutants générés par la technologie CRISPR/Cas9 de nombreux individus. Les deux principaux avantages de cette technique sont qu’elle peut se faire en quelques heures et qu’elle est applicable à une multitude d’organismes. La conception de l’amorce peut être difficile pour certains gènes et plusieurs cycles de conception et de vérification de l’amorce peuvent être nécessaires pour rendre HRMA efficace.
Pour effectuer une PCR de dégradé, commencez par préparer un mélange maître. Retirez ensuite 19 microlitres du mélange principal pour le contrôle sans gabarit ou NTC dans une plaque de 96 puits. Ensuite, ajoutez le modèle au mélange principal restant.
Aliquote 20 microlitres du mélange d’échantillon dans la plaque de 96 puits. Effectuez la PCR en suivant les paramètres de cycle, puis générez les profils de fusion thermique en utilisant les paramètres mentionnés dans le manuscrit. Après avoir rassemblé tout le matériel requis, préparez un mélange maître avec 0,5 microlitre du réactif de libération d’ADN et 20 microlitres de tampon de dilution par individu à génotyper.
À l’aide d’une pipette multicanal, aliquotez 20 microlitres du mélange dans une plaque pcR et laissez la plaque PCR sur la glace. Ensuite, placez les moustiques G1 anesthésiés dans une boîte de Petri en verre pour les garder sous sédation et placez huit moustiques de type sauvage dans la deuxième boîte de Pétri. Essuyez une pince à épiler avec de l’éthanol à 70% et utilisez la pince à épiler désinfectée pour enlever l’une des pattes postérieures des moustiques.
Ensuite, immergez la jambe dans la solution de réactif de libération d’ADN. Placez le moustique dans le flacon correspondant et fermez le flacon avec une éponge. Une fois cela fait, essuyez la pince à épiler avec de l’éthanol à 70% avant de retirer la jambe du moustique suivant jusqu’à ce que la plaque de 96 puits soit terminée.
Plus tard, scellez la plaque avec un joint optique de plaque PCR et incubez la plaque PCR contenant les pieds à température ambiante pendant deux à cinq minutes, suivie d’une incubation à 98 degrés Celsius pendant deux minutes. Laissez la plaque refroidir à la température ambiante. Pour la PCR, préparez un mélange maître contenant les composants préférés, puis utilisez une pipette multicanal pour transférer 19 microlitres du mélange maître dans chaque puits de la plaque de 96 puits.
Après avoir transféré un microlitre de la solution de libération d’ADN contenant de l’ADN de moustique préalablement préparé sur la plaque, scellez la plaque avec un joint optique de plaque PCR. Effectuez la PCR avec les paramètres de cycle appropriés pour générer des profils de fusion thermique en suivant les paramètres décrits dans le manuscrit, puis examinez les profils de fusion en attribuant un contrôle de type sauvage au cluster de référence. Marquez les différents clusters avec les couleurs correspondantes sur le modèle à 96 puits.
Ensuite, sélectionnez les individus avec des courbes d’intérêt et retirez les individus sélectionnés des tubes à la croix arrière. Le sang nourrit les femelles, suivies de la collecte de G2A. Dans l’analyse représentative, l’analyse de séquence du mutant ZIP11 d’Aedes aegypti est montrée.
L’électrophérogramme des mutants hétérozygotes Aedes aegypti ZIP11 indiquait la position nucléotidique où l’indel s’est produit. L’indel est représenté par un passage de pics simples à doubles car les positions polymorphes montrent les deux nucléotides en concomitance. À la fin de l’exécution, le nombre de paires de bases supprimées ou insérées a été calculé en comptant les pics uniques.
Les moustiques contenant des mutations dans les gènes Aedes aegypti ZIP11 et myo-fem ont été génotypés et séquencés vérifiés à l’aide de l’analyse de fusion à haute résolution de HRMA. Les signaux fluorescents des échantillons ont été normalisés à des valeurs relatives de un à zéro. De plus, chaque courbe a été soustraite de la référence de type sauvage et notée le grossissement correspondant.
Une affectation automatique de cluster ayant échoué est indiquée dans les résultats représentatifs, où une distinction correcte entre les groupes n’a pas été faite. De plus, chaque échantillon a été analysé individuellement et assigné aux groupes appropriés en fonction de la similitude avec les échantillons de référence d’hétérozygotes, d’homozygotes et de transhétérozygotes. Après avoir effectué des HRMA, le séquençage de l’ADN des individus mutés est nécessaire pour analyser les indels et identifier les autres mutations dans la séquence ciblée.
