Il nostro metodo di dissezione consente un isolamento preciso della nicchia neurogena ventricolare ed è quindi adatto per studiare il microambiente molecolare di questa nicchia. Il vantaggio principale di questo metodo di dissezione è che è preciso, efficiente e provoca una minima perturbazione tissutale pur essendo compatibile con la spettrometria di massa per l'analisi del proteoma. In questo protocollo, estraiamo la nicchia neurogena del ventricolo da un cervello di topo, ma questo metodo può essere applicato anche ad altre specie e in vari stati di salute e malattia.
La tecnica potrebbe richiedere un certo allenamento. soprattutto con i tagli del bisturi quando si espone ed estrae la nicchia neurogena ventricolare. Dopo l'eutanasia di un topo maschio C57 nero / 6 di 8-10 settimane, estrarre il cervello mediante dissezione manuale e metterlo in un piatto di coltura contenente un mezzo di dissezione ghiacciato.
Usando un bisturi, rimuovere il bulbo olfattivo facendo un taglio coronale dritto tra il bulbo olfattivo e il polo interno della corteccia. Quindi, rimuovere il polo anteriore della corteccia effettuando un taglio coronale, assicurandosi che i ventricoli laterali siano visibili nel piano coronale. Quindi, usando le forbici, aprire entrambi i ventricoli laterali dall'alto, iniziando con la sezione sagittale dalla superficie corticale al lume ventricolare.
Allungare questo taglio in modo a forma di C dopo la flessione ventricolare. Quindi, collegare le estremità caudali dell'incisione sagittale sinistra e destra, impiegando un ulteriore taglio coronale. Quindi, rimuovere la corteccia e il corpo calloso che coprono le pareti ventricolari mediali.
Se il tessuto è attaccato alle pareti ventricolari mediali, effettuare tagli aggiuntivi o sollevare la corteccia e il corpo calloso con le forbici per rimuovere il tessuto. Quindi, usando la pinza, rimuovere la corteccia e il corpo calloso che coprono i ventricoli laterali. Usando la pinza, allargare con cura le pareti ventricolari e rimuovere il plesso coroideo.
Quindi, metti il cervello su un vetrino e posiziona il vetrino sopra il ghiaccio secco per congelare il cervello con le pareti ventricolari nella configurazione aperta. Prima di sezionare, assicurarsi che il cervello sia attaccato alla piastra di attacco del criostato nel cervello posteriore con un mezzo di incorporamento per i tessuti congelati. Inoltre, assicurarsi che nessun mezzo incorporante entri in contatto con il cervello anteriore, specialmente nei ventricoli.
Quindi, tagliare sezioni coronali del cervello spesse da 50 a 100 micrometri fino alla fine del ventricolo laterale e montare le sezioni sui vetrini. Posizionare i vetrini sul ghiaccio secco sotto un microscopio di dissezione. Sollevare le fette dal ghiaccio secco per 15-30 secondi per ottenere un breve scongelamento incompleto, rendendo la mielina compatta dello striato osservabile come punti bianchi densi.
Quindi, utilizzando un bisturi pre-raffreddato, separare la zona subependimale dallo striato adiacente e trasferirla come un pezzo intero o sezionato in due o quattro parti in un tubo microcentrifuga usando il bordo smussato del bisturi raffreddato. Quindi fai lo stesso per la zona ventricolare mediale. Le capsule interne dello striato associate alla mielina e positive alla glicoproteina sono state identificate nei campioni di intero importo, ma raramente nei campioni di dissezione della criosezione tramite immunoistochimica.
La contaminazione striatale nei campioni integrali è stata confermata dall'arricchimento delle proteine mieliniche nella zona subependimale, rispetto ai campioni di corteccia somato-sensoriale. Al contrario, i confronti di queste proteine marcatori mieliniche nei campioni di dissezione crio-sezione non hanno mostrato differenze significative nella zona subependimale e nei campioni di corteccia somato-sensoriale. Confrontando i risultati della spettrometria di massa tra la dissezione a sezione criometrica e la microdissezione a cattura laser, la microdissezione a cattura laser ha prodotto circa la metà delle proteine quantificate, sebbene il tempo di raccolta dei tessuti fosse circa il doppio.
L'analisi dei componenti principali rivela che esiste una maggiore variabilità tra i campioni raccolti con microdissezione a cattura laser, raffigurati come quadrati, rispetto a quelli raccolti con la dissezione a sezione criometrica, raffigurati come cerchi. Un test di arricchimento dell'annotazione 2D tra dissezione crio-sezione e microdissezione a cattura laser per le zone ependimali subependimali e mediali ha rivelato un arricchimento simile in entrambi i metodi e regioni per le proteine associate allo spazio extracellulare. La dissezione della crio-sezione fornisce un'identificazione e una quantificazione più robuste della neurogenesi nelle proteine della matrice extracellulare associate alla zona subependimale.
Nel caso della tenascina-C, solo la dissezione della criosezione mostrava un arricchimento nella zona subependimale rispetto alla zona ependimale mediale. Assicurati che le sezioni cerebrali sulle diapositive non si scongelino completamente. Nel complesso, è bene praticare i passaggi della procedura di dissezione per un risultato coerente.
Il metodo di dissezione può anche essere utilizzato con altri metodi di analisi delle proteine che possono facilmente rilevare proteine molto basse abbondanti, come fattori di crescita e citochine. Questo metodo di microdissezione ci ha permesso di identificare un nuovo regolatore della neurogenesi e crediamo che consentirà ad altri di identificare altri regolatori della neurogenesi in vari contesti.
