우리의 해부 방법은 심실 신경 성 틈새 시장을 정밀하게 분리할 수 있게 해주며, 따라서 이 틈새 틈새의 분자 미세 환경을 연구하는 데 적합합니다. 이 해부 방법의 주요 장점은 정확하고 효율적이며 최소한의 조직 혼란을 일으키면서도 프로테오메 분석을 위한 질량 분광법과 호환된다는 것입니다. 이 프로토콜에서, 우리는 마우스 두뇌에서 심실의 신경 성 틈새 시장을 추출, 하지만이 방법은 또한 다른 종 및 건강 및 질병의 다양 한 상태에 적용 될 수 있습니다.
이 기술은 약간의 훈련이 필요할 수 있습니다. 특히 메스가 심실 신경 유발 틈새 시장을 노출하고 추출 할 때 잘라. 8-10주 된 C57 블랙/6 수컷 마우스를 안락사한 후 수동 해부로 뇌를 추출하여 얼음-차가운 해부 배지가 들어 있는 문화 접시에 놓습니다.
메스를 사용하여 후각 전구와 피질의 내부 기둥 사이에 직선 관상 절단을 하여 후각 전구를 제거하십시오. 다음으로, 관상 동맥 절단을 함으로써 피질의 전방 극을 제거하여 관상 평면에서 측면 심실을 볼 수 있도록 합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 피질 표면에서 심실 루멘까지 좌측 심실을 모두 열어 보입니다.
심실 굴곡 다음 C 자형 방식으로이 컷을 길게. 다음으로, 왼쪽과 오른쪽 처진 절개의 코달 끝을 연결하여 추가 코로나 컷을 사용합니다. 다음으로 내측 심실 벽을 덮고 있는 피질과 코퍼스 캘로섬을 제거합니다.
조직이 내측 심실 벽에 부착되면, 추가 절단을하거나 조직을 제거하기 위해 가위로 피질과 코퍼스 캘로섬을 들어 올립니다. 그런 다음, 집게를 사용하여, 측면 심실을 덮고 피질과 코퍼스 callosum을 제거합니다. 집게를 사용하여 심실 벽을 조심스럽게 펴고 choroid 신경을 제거합니다.
그런 다음, 유리 슬라이드에 뇌를 넣고 열린 구성에서 심실 벽으로 뇌를 동결하기 위해 드라이 아이스 위에 슬라이드를 배치합니다. 단면하기 전에, 뇌가 얼어 붙은 조직을 위한 포함 매체와 뒤이어 뇌의 극저온 부착 판에 부착되어 있는지 확인하십시오. 또한, 포함 매체가 특히 심실에서 전조 뇌와 접촉하지 않도록하십시오.
그런 다음 측면 심실이 끝날 때까지 뇌의 50-100 마이크로미터 두께의 관상 동맥 부분을 자르고 유리 슬라이드의 섹션을 장착합니다. 해부 현미경 아래에 드라이 아이스에 유리 슬라이드를 놓습니다. 드라이 아이스에서 슬라이스를 15~30초 동안 들어 올려 짧고 불완전한 해동을 이루면 조밀한 흰색 점으로 관찰할 수 있는 줄무늬의 콤팩트 마일린이 됩니다.
이어서, 미리 냉각된 메스를 이용하여, 인접한 줄기에서 subependymal 영역을 분리하고, 냉각된 메스의 무딘 가장자리를 사용하여 2~4부로 분리하여 미세원심분리기 튜브로 분리한다. 그런 다음 내측 심실 영역에 대해 동일한 작업을 수행합니다. 골린-관련, 당단백질 양성 내부 캡슐의 전체마운트 샘플에서 확인되었지만 면역 작용화학을 통한 극저온 단면도 시료에서는 거의 확인되지 않았다.
전체마운트 샘플에서의 현자 오염은 소마토 감각 피질 샘플에 비해 피펜디말 영역에서 골수린 단백질의 농축에 의해 확인되었다. 대조적으로, 극저온 단면-해부 견본에 있는 이 골골 마커 단백질의 비교는 subependymal 영역 및 somato 감각 피질 견본에 있는 유의한 다름을 보여주지 않았습니다. 저온-절제-해부와 레이저 포획 미세 절 사이의 질량 분광법 결과를 비교할 때, 레이저 포획 마이크로절은 조직 수집 시간이 약 두 배길이었지만, 많은 정량화 된 단백질의 약 절반을 산출했다.
원리 성분 분석은 레이저 포획 마이크로 절로 수집 된 샘플 중 더 큰 가변성이 있음을 보여줍니다, 사각형으로 묘사, 극저온 섹션 해부로 수집 된 것보다, 원으로 묘사. 극저온-절제및 레이저 포획 미세절 사이의 2D 음장 농축 시험은 세포외 공간과 관련된 단백질에 대한 방법과 영역 모두에서 유사한 농축을 밝혀냈습니다. 극저온-절제는 subependymal 영역 관련 세포외 매트릭스 단백질에서 신경 발생의 보다 강력한 식별 및 정량화를 제공합니다.
테나신-C의 경우, 내측 연화영역에 비해 하부 영역에서 농축을 표시하는 극저온-절부만. 슬라이드의 뇌 섹션이 완전히 해동되지 않도록 하십시오. 전반적으로, 일관된 결과를 위해 해부 절차의 단계를 연습하는 것이 좋습니다.
해부 방법은 또한 성장 인자 및 사이토카인과 같은 매우 낮은 풍부한 단백질을 쉽게 검출할 수 있는 다른 단백질 분석 방법과 함께 사용될 수 있다. 이 미세 절제 방법은 우리가 새로운 신경 발생 조절기를 식별할 수 있었습니다, 우리는 다른 사람들이 각종 맥락에서 신경 발생의 그밖 레귤레이터를 확인하는 것을 허용할 것이라는 점을 믿습니다.
