我々の解剖法は、心室神経原性ニッチの正確な単離を可能にし、したがって、このニッチの分子微小環境を研究するのに適している。この解剖方法の主な利点は、正確で効率的であり、プロテオーム分析のための質量分析と互換性がある間、最小限の組織摂動を引き起こすということです。このプロトコルでは、マウスの脳から心室の神経性ニッチを抽出しますが、この方法は他の種や健康や病気の様々な状態にも適用できます。
このテクニックには、いくつかのトレーニングが必要な場合があります。特に、心室神経原性ニッチを露出して抽出するときのメスカットで。8〜10週齢のC57黒/6オスマウスを安楽死させた後、手動解剖によって脳を抽出し、氷冷解剖培地を含む培養皿に入れる。
メスを使用して、嗅球と皮質の内極の間にまっすぐなコロナカットを行うことによって嗅球を取り除きます。次に、コロナカットを行って皮質の前極を取り除き、側心室がコロナ平面に見えるようにします。次に、はさみを使用して、側側心室を皮質表面から心室内腔に開始して、上から両方の側心室を開く。
この切り口は、心室屈曲に続いてC字型にして伸ばします。次に、左右の矢状切開部の尾端を接続し、追加のコロナカットを採用する。次に、心室壁を覆う皮質と脳梁を取り除く。
組織が心室壁に取り付けられている場合は、追加の切り傷を行うか、組織を取り除くためにはさみで皮質と脳梁を持ち上げます。次に鉗子を使用して、側心室を覆う皮質および脳梁を取り除く。鉗子を使用して、慎重に心室の壁を広げ、脈絡叢を除去する。
次に、ガラススライドの上に脳を置き、ドライアイスの上にスライドを置き、オープン構成の心室壁で脳を凍結します。切除する前に、脳が凍結組織用の埋め込み媒体を備えた後部脳のクライオスタット付着プレートに取り付けられていることを確認してください。さらに、埋め込み培地が前脳、特に心室に接触しないようにしてください。
次いで、脳の50~100マイクロメートルの厚さのコロナ部分を横心室の終わりまで切り取り、その切片をスライドガラスに取り付けます。ガラススライドをドライアイスの上に置き、解剖顕微鏡で下さい。ドライアイスからスライスを15〜30秒間持ち上げて、短くて不完全な解凍を達成し、線条体のコンパクトミエリンを密な白い点として観察します。
次に、あらかじめ冷却されたメスを使用して、隣接する線条体から皮下ゾーンを分離し、冷却されたメスの鈍い端を使用して、それを全体の部分として、または2〜4個に切り離してマイクロ遠心管に移します。その後、内側の心室ゾーンに対して同じことを行います。ミエリンに関連する、線条体の糖タンパク質陽性の内部カプセルは、全マウントサンプルで同定されたが、免疫体系化学を介したクライオセクション解剖サンプルではめったに同定されなかった。
全山サンプル中の線条体汚染は、体性感覚皮質サンプルと比較して、腹膜領域におけるミエリンタンパク質の濃縮によって確認された。対照的に、クライオセクション解剖サンプルにおけるこれらのミエリンマーカータンパク質の比較は、皮下帯および体性感覚皮質サンプルに有意な差を示さなかった。質量分析結果をクライオセクション解剖とレーザー捕捉マイクロ解剖の結果を比較すると、レーザー捕捉マイクロ解剖は定量化されたタンパク質の約半分を生み出したが、組織採取時間は約2倍であった。
原理成分分析は、円として描かれた凍結セクション解剖で収集されたものよりも、正方形として描かれたレーザー捕捉マイクロ解剖で収集されたサンプルの間で大きな変動性があることを明らかにした。皮下および内側のエペンディマルゾーンのクライオセクション解剖とレーザーキャプチャマイクロ解剖の間の2D注釈濃縮試験は、細胞外空間に関連するタンパク質の方法と領域の両方で同様の濃縮を明らかにした。クライオセクション解剖は、皮下ゾーン関連細胞外マトリックスタンパク質における神経新生のより強固な同定と定量化を提供する。
テナシンCの場合、クライオセクション解剖のみが、内側のエペンディマルゾーンと比較して、皮下帯に濃縮を示した。スライド上の脳のセクションが完全に解凍されないことを確認します。全体的に、一貫した結果を得るために、解剖手順の手順を実践することをお勧めします。
解剖方法は、成長因子やサイトカインなどの非常に低い豊富なタンパク質を容易に検出できる他のタンパク質分析方法と併用することもできます。このマイクロディセクション法は、新しい神経新生調節因子を同定することを可能にし、他の人が様々な文脈で神経新生の他の調節因子を同定することを可能にすると信じています。
