Ce protocole a été développé pour les opérateurs novices du NanoSight LM10. En suivant les instructions étape par étape, des résultats précis et reproductibles peuvent être obtenus. Cette technique permet d’assurer des résultats cohérents sur plusieurs essais, quel que soit le niveau de compétence de l’utilisateur.
La caractérisation des nanoparticules, en particulier la quantification, continue d’être un défi dans le domaine de la recherche sur les vésicules extracellulaires. Ce protocole permet une analyse cohérente de la taille et de la concentration des nanoparticules en suspension. Commencez par nettoyer les surfaces vitrées du module laser avec un nettoyant pour lentilles et du papier pour lentilles de bonne qualité.
Avant l’assemblage du module, assurez-vous que le joint torique est correctement installé dans la rainure du couvercle de la cellule d’écoulement. Placez ensuite le couvercle de la cellule d’écoulement sur le module laser, en vous assurant que les contacts électriques sont dans la bonne orientation. Ensuite, placez les quatre vis à pouce à ressort à travers la plaque de cellule d’écoulement et engagez les filetages du module laser sans serrer individuellement.
Tout en exerçant une pression uniforme sur le couvercle de la cellule d’écoulement, serrez uniformément les vis du pouce de manière diagonale alternée jusqu’à ce qu’elles soient bien ajustées. Rincez trois fois deux seringues à tuberculine d’un millilitre avec des adaptateurs à verrouillage glissant avec un millilitre de DPBS. Retirez et jetez le piston de la première seringue de tuberculine avant d’insérer la seringue dans l’orifice restant pour servir de diluant ou de réservoir d’échantillon vide.
Remplissez ensuite la deuxième seringue avec un millilitre de DPBS et fixez-la à l’orifice d’entrée du couvercle de la cellule d’écoulement. Maintenez le module laser incliné avec l’orifice de la seringue de sortie surélevé pour permettre à l’air d’être purgé de la chambre pendant que le DPBS est injecté lentement dans le module laser. Rincez le DPBS restant du module laser en injectant un millilitre d’air dans l’orifice d’entrée.
Répétez le rinçage deux fois. Après le dernier rinçage, videz le module laser aussi complètement que possible et chargez le module pour la mise au point et le positionnement. Ouvrez le logiciel.
Sous l’onglet capture dans le coin supérieur gauche, cliquez sur Démarrer l’appareil photo. Si l’appareil photo s’éteint automatiquement après cinq minutes, cliquez sur Démarrer l’appareil photo pour le redémarrer. Dans le même onglet, ajustez le niveau de la caméra à 14 à 16 pour éclaircir la ligne laser et simplifier l’identification et la mise au point des particules.
En déplaçant le curseur supérieur sur le côté gauche de la tête à l’intérieur ou à l’extérieur, détournez l’image de la caméra vers les oculaires. Dans le champ de vision, recherchez la zone de densité accrue, appelée empreinte du pouce et centre, et concentrez l’empreinte du pouce verticalement. Dans le champ de vision, centrez la ligne laser, puis déplacez le curseur supérieur pour détourner la lumière vers la caméra comme observé sur l’écran de l’ordinateur.
L’image sur l’écran de l’ordinateur est une image miroir de la vue dans les oculaires du microscope. Ajustez la mise au point pour affiner l’image des particules en mouvement individuelles sur l’écran avec le bouton de mise au point. Pour charger les échantillons, prélever un millilitre de l’échantillon dans une seringue à tuberculine rincée d’un millilitre et fixer la seringue à l’orifice d’entrée du couvercle de la cellule d’écoulement.
Continuez à avancer le piston jusqu’à ce que le liquide soit évident dans la seringue ouverte fixée à l’orifice de sortie. Le module doit être incliné pour permettre à l’air d’être purgé du module laser. Dans la vue de la caméra, déplacez la mise au point vers la droite de la ligne laser vers une zone d’un nombre uniforme de particules.
Ajustez l’orientation verticale pour centrer les bandes horizontales de lumière et recentrez-vous jusqu’à ce que le plus grand nombre de particules soit visible. S’assurer que la position de l’objectif est cohérente pour toutes les mesures ultérieures. Ajustez le niveau de l’appareil photo au point où le symbole d’information sombre clignote par intermittence en haut à droite de la vue de l’appareil photo.
Pour l’analyse de suivi des nanoparticules, ou NTA, réglez la durée sur 30 ou 60 secondes et le nombre de vidéos sur cinq. Pour modifier le nom de fichier de base existant, cliquez sur l’onglet d’un nouveau site de stockage pour les données générées avec un nouveau nom de fichier. Cochez ensuite la case température cible pour saisir la température souhaitée et cliquez sur créer un script pour réutiliser la mesure standard.
Une fois l’exemple chargé et l’expérience prête à s’exécuter, cliquez sur Créer et exécuter un script. Dans l’écran contextuel Définir les détails du rapport, remplissez les champs avec les informations nécessaires sur l’opérateur, l’échantillon et le diluant. Lorsque tous les champs souhaités ont été remplis, cliquez sur Paramètres OK pour lancer le script.
Avant chaque capture vidéo, recherchez une invite pour faire avancer le piston manuellement. Injecter environ 0,05 millilitre de l’échantillon dans la chambre laser. Lorsque les particules s’immobilisent, cliquez sur OK. Une fois la cinquième capture vidéo terminée, une boîte de confirmation des paramètres apparaîtra avec la boîte de processus.
Comme les images sont avancées manuellement à partir du bas de l’écran vidéo, notez le nombre de croix bleues produisant des particules à l’écran et définissez le seuil de détection pour le traitement de l’échantillon. Attendez que les vidéos soient automatiquement traitées dans un histogramme de résultats avant qu’une notification d’achèvement de la boîte de dialogue ne s’affiche, puis appuyez sur OK. Une fois que la zone paramètres d’exportation s’affiche, enregistrez les résultats en cliquant sur Exporter. Mettez en surbrillance les cinq vidéos de capture répertoriées dans l’expérience en cours.
Ensuite, cliquez sur traiter les fichiers sélectionnés et attendez que la zone de confirmation des paramètres apparaisse dans la zone de processus pour flasher pour modifier le seuil de détection, puis ajustez le seuil de détection au niveau souhaité et accédez au paramètre et cliquez sur OK. Les vidéos seront traitées automatiquement dans un histogramme des résultats et une boîte de dialogue de notification d’achèvement sera affichée. Cliquez OK.In l’analyse représentative, les résultats de l’analyse de nanotracking, ou NTA, pour les échantillons de liposomes et un diluant DPBS représentatif sont affichés. Les échantillons filtrés avaient un diamètre moyen de particules de 108 nanomètres et une concentration de 7,4 fois 10 à la huitième particule par millilitre.
En revanche, les échantillons non filtrés avaient un diamètre moyen de particules de 159 nanomètres et une concentration de 7,6 fois 10 à la huitième particule par millilitre. Au niveau combiné des caméras, lorsque le seuil de détection a été porté de deux à cinq, la taille moyenne et la taille des particules de mode ont montré une diminution significative de la taille des particules des échantillons filtrés. Les concentrations de particules aux niveaux combinés des caméras ont diminué à mesure que le seuil de détection était augmenté.
Aucune différence significative dans les concentrations de particules entre les échantillons filtrés et non filtrés n’a été détectée. Aux seuils de détection combinés, à mesure que le niveau de la caméra passait de 12 à 14, une diminution de la taille moyenne et du mode des particules filtrées a été observée. Les concentrations de particules aux seuils de détection combinés ont augmenté à mesure que les niveaux de caméra passaient de 12 à 14.
Aucune différence significative entre les échantillons filtrés et non filtrés n’a été observée. Les étapes 4.1 à 5.2 sont importantes pour trouver la bonne zone de visualisation. L’obtention de résultats cohérents sur plusieurs essais dépend de cette compétence reproductible.
La diffusion dynamique de la lumière est souvent utilisée comme compagnon de l’analyse de suivi des nanoparticules principalement pour obtenir le potentiel zêta, qui est la charge de surface des particules. Pour l’analyse des nanoparticules, la NTA continue d’être une méthode très précieuse de quantification des particules utile pour la recherche sur les vésicules extracellulaires.
