Este protocolo fue desarrollado para operadores novatos del NanoSight LM10. Siguiendo las instrucciones paso a paso, se pueden obtener resultados precisos y reproducibles. Esta técnica ayuda a garantizar resultados consistentes en múltiples ejecuciones de prueba, independientemente del nivel de habilidad del usuario.
La caracterización de nanopartículas, especialmente la cuantificación, sigue siendo un desafío en el campo de la investigación de vesículas extracelulares. Este protocolo permite un análisis consistente de tamaño y concentración de nanopartículas en suspensión. Comience por limpiar las superficies de vidrio del módulo láser con un limpiador de lentes de buena calidad y papel de lente.
Antes del montaje del módulo, asegúrese de que el sello de la junta tórica esté correctamente asentado en la ranura de la cubierta de la celda de flujo. Luego coloque la cubierta de la celda de flujo en el módulo láser, asegurándose de que los contactos eléctricos estén en la orientación adecuada. A continuación, coloque los cuatro tornillos de pulgar cargados por resorte a través de la placa de la celda de flujo y enganche las roscas del módulo láser sin apretar individualmente.
Mientras ejerce una presión uniforme sobre la cubierta de la celda de flujo, apriete uniformemente los tornillos del pulgar de manera diagonal alterna hasta que se ajusten. Enjuague dos jeringas de tuberculina de un mililitro con adaptadores de bloqueo deslizante tres veces con un mililitro de DPBS. Retire y deseche el émbolo de la primera jeringa de tuberculina antes de insertar la jeringa en el puerto restante para que sirva como diluyente vacío o depósito de muestra.
A continuación, llene la segunda jeringa con un mililitro de DPBS y conéctela al puerto de entrada de la cubierta de la celda de flujo. Mantenga el módulo láser inclinado con el puerto de la jeringa de salida elevado para permitir que el aire se purgue de la cámara a medida que el DPBS se inyecta lentamente en el módulo láser. Enjuague el DPBS restante del módulo láser inyectando un mililitro de aire en el puerto de entrada.
Repita el enjuague dos veces. Después del último lavado, vacíe el módulo láser lo más completamente posible y cargue el módulo para enfocar y posicionar. Abra el software.
Debajo de la pestaña de captura en el cuadro de la esquina superior izquierda, haga clic en Iniciar cámara. Si la cámara se apaga automáticamente después de cinco minutos, haga clic en Iniciar cámara para reiniciarla. En la misma pestaña, ajuste el nivel de la cámara a 14 a 16 para iluminar la línea láser y simplificar la identificación y el enfoque de partículas.
Al mover el control deslizante superior en el lado izquierdo de la pieza principal hacia adentro o hacia afuera, desvíe la imagen de la cámara a los oculares. En el campo de visión, busque el área de mayor densidad, conocida como huella digital y centro, y enfoque la huella digital verticalmente. En el campo de visión, centre la línea láser y, a continuación, mueva el control deslizante superior para desviar la luz hacia la cámara como se observa en la pantalla de la computadora.
La imagen en la pantalla de la computadora es una imagen especular de la vista en los oculares del microscopio. Ajuste el enfoque para enfocar la imagen de partículas individuales en movimiento en la pantalla con la perilla de enfoque. Para cargar las muestras, extraiga un mililitro de la muestra en una jeringa de tuberculina de un mililitro enjuagada y conecte la jeringa al puerto de entrada de la cubierta de la celda de flujo.
Siga avanzando el émbolo hasta que el líquido sea evidente en la jeringa abierta unida al puerto de salida. El módulo debe estar inclinado para permitir que el aire se purgue del módulo láser. En la vista de la cámara, mueva el enfoque a la derecha de la línea láser a un área de un número uniforme de partículas.
Ajuste la orientación vertical para centrar las bandas horizontales de luz y vuelva a enfocar hasta que el mayor número de partículas esté a la vista. Asegúrese de mantener la posición del enfoque consistente para todas las medidas posteriores. Ajuste el nivel de la cámara hasta el punto de que el símbolo de información oscura parpadee intermitentemente en la parte superior derecha de la vista de la cámara.
Para el análisis de seguimiento de nanopartículas, o NTA, establezca la duración en 30 o 60 segundos y el número de videos en cinco. Para cambiar el nombre de archivo base existente, haga clic en la ficha de un nuevo sitio de almacenamiento para los datos generados con un nuevo nombre de archivo. Luego marque la casilla de temperatura objetivo para ingresar la temperatura deseada y haga clic en crear script para reutilizar la medición estándar.
Una vez que se cargue el ejemplo y el experimento esté listo para ejecutarse, haga clic en crear y ejecutar script. En la pantalla emergente detalles del informe establecido, complete los campos con la información necesaria sobre el operador, la muestra y el diluyente. Cuando se hayan rellenado todos los campos deseados, haga clic en Configuración aceptar para iniciar el script.
Antes de cada captura de video, busque un mensaje para avanzar el émbolo manualmente. Inyecte aproximadamente 0,05 mililitros de la muestra en la cámara láser. A medida que las partículas se descansen, haga clic en Aceptar. Al completar la quinta captura de video, aparecerá un cuadro de confirmación de configuración junto con el cuadro de proceso.
Como los fotogramas se avanzan manualmente desde la parte inferior de la pantalla de video, observe el número de cruces azules que forman partículas en la pantalla y establezca el umbral de detección para el procesamiento de la muestra. Espere a que los videos se procesen automáticamente en un histograma de resultados antes de que se muestre una notificación de finalización en el cuadro de diálogo, luego presione Aceptar. Después de que aparezca el cuadro de configuración de exportación, guarde los resultados haciendo clic en exportar. Resalte los cinco videos de captura enumerados en el experimento actual.
A continuación, haga clic en procesar archivos seleccionados y espere a que aparezca el cuadro de confirmación de configuración en el cuadro de proceso para parpadear para cambiar el umbral de detección, luego ajuste el umbral de detección al nivel deseado y vaya a configuración y haga clic en Aceptar. Los videos se procesarán automáticamente en un histograma de resultados y se mostrará una notificación de finalización en un cuadro de diálogo. Haga clic OK.In el análisis representativo, se muestran los resultados del análisis de nanoseguimiento, o NTA, para las muestras de liposomas y un diluyente DPBS representativo. Las muestras filtradas tenían un diámetro medio de partículas de 108 nanómetros y una concentración de 7,4 veces 10 a las octavas partículas por mililitro.
En contraste, las muestras sin filtrar tenían un diámetro medio de partículas de 159 nanómetros y una concentración de 7,6 veces 10 a las octavas partículas por mililitro. A niveles de cámara combinados, a medida que el umbral de detección se incrementó de dos a cinco, el tamaño de partícula medio y de modo mostró una disminución significativa en el tamaño de partícula de las muestras filtradas. Las concentraciones de partículas a niveles de cámara combinados disminuyeron a medida que aumentaba el umbral de detección.
No se detectaron diferencias significativas en las concentraciones de partículas entre las muestras filtradas y no filtradas. En los umbrales de detección combinados, a medida que el nivel de la cámara aumentó de 12 a 14, se observó una disminución en el tamaño de partícula medio y de modo de las muestras filtradas. Las concentraciones de partículas en los umbrales de detección combinados aumentaron a medida que los niveles de la cámara aumentaron de 12 a 14.
No se observaron diferencias significativas entre las muestras filtradas y no filtradas. Los pasos 4.1 a 5.2 son importantes para encontrar el área de visualización correcta. Lograr resultados consistentes en múltiples ejecuciones de prueba depende de esta habilidad repetible.
La dispersión dinámica de la luz se utiliza a menudo como un compañero para el análisis de seguimiento de nanopartículas principalmente para obtener el potencial zeta, que es la carga superficial de las partículas. Para el análisis de nanopartículas, el NTA sigue siendo un método muy valioso de cuantificación de partículas útil para la investigación de vesículas extracelulares.
