Questo protocollo è stato sviluppato per gli operatori alle prime armi del NanoSight LM10. Seguendo le istruzioni passo-passo, è possibile ottenere risultati accurati e riproducibili. Questa tecnica aiuta a garantire risultati coerenti in più cicli di prova indipendentemente dal livello di abilità dell'utente.
La caratterizzazione delle nanoparticelle, in particolare la quantificazione, continua ad essere una sfida nel campo della ricerca sulle vescicole extracellulari. Questo protocollo consente un'analisi coerente delle dimensioni e della concentrazione delle nanoparticelle in sospensione. Inizia pulendo le superfici vetrate del modulo laser con un detergente per lenti di buona qualità e carta per lenti.
Prima di assemblare il modulo, assicurarsi che la guarnizione dell'O-ring sia posizionata correttamente nella scanalatura del coperchio della cella di flusso. Quindi posizionare il coperchio della cella di flusso sul modulo laser, assicurandosi che i contatti elettrici siano nel corretto orientamento. Quindi, posizionare le quattro viti a pollice caricate a molla attraverso la piastra della cella di flusso e innestare le filettature del modulo laser senza stringere individualmente.
Mentre si esercita una pressione uniforme sul coperchio della cella di flusso, stringere uniformemente le viti a pollice in modo diagonale alternato fino a quando non si stringono. Lavare due siringhe di tubercolina da un millilitro con adattatori antiscivolo tre volte con un millilitro di DPBS. Rimuovere e scartare lo stantuffo dalla prima siringa di tubercolina prima di inserire la siringa nella porta rimanente per fungere da diluente svuotato o serbatoio del campione.
Quindi riempire la seconda siringa con un millilitro di DPBS e collegarla alla porta di ingresso del coperchio della cella di flusso. Tenere il modulo laser inclinato con la porta della siringa di uscita sollevata per consentire l'eliminazione dell'aria dalla camera mentre il DPBS viene iniettato lentamente nel modulo laser. Lavare il DPBS rimanente dal modulo laser iniettando un millilitro di aria nella porta di ingresso.
Ripetere il lavaggio due volte. Dopo l'ultimo lavaggio, svuotare il modulo laser nel modo più completo possibile e caricare il modulo per la messa a fuoco e il posizionamento. Aprire il software.
Nella scheda Acquisizione nella casella nell'angolo in alto a sinistra, fare clic su Avvia fotocamera. Se la fotocamera si spegne automaticamente dopo cinque minuti, fare clic su Avvia fotocamera per riavviarla. Nella stessa scheda, regolare il livello della fotocamera su 14-16 per illuminare la linea laser e semplificare l'identificazione e la messa a fuoco delle particelle.
Spostando il cursore superiore sul lato sinistro del pezzo di testa dentro o fuori, deviare l'immagine dalla fotocamera agli oculari. Nel campo visivo, individuare l'area di maggiore densità, denominata identificazione personale e centro, e mettere a fuoco l'identificazione personale verticalmente. Nel campo visivo, centrare la linea laser, quindi spostare il cursore superiore per deviare la luce verso la fotocamera come osservato sullo schermo del computer.
L'immagine sullo schermo del computer è un'immagine speculare dalla vista negli oculari del microscopio. Regola la messa a fuoco per rendere più nitida l'immagine delle singole particelle in movimento sullo schermo con la manopola di messa a fuoco. Per caricare i campioni, prelevare un millilitro del campione in una siringa di tubercolina da un millilitro risciacquata e collegare la siringa alla porta di ingresso del coperchio della cella di flusso.
Continuare a far avanzare lo stantuffo fino a quando il fluido non è evidente nella siringa aperta attaccata alla porta di uscita. Il modulo deve essere inclinato per consentire l'eliminazione dell'aria dal modulo laser. Nella vista della fotocamera, spostare la messa a fuoco a destra della linea laser su un'area di un numero uniforme di particelle.
Regolate l'orientamento verticale per centrare le bande orizzontali di luce e rimettere a fuoco fino a quando non è visualizzato il maggior numero di particelle. Assicurarsi di mantenere la posizione del focus coerente per tutte le misure successive. Regolare il livello della fotocamera in modo che il simbolo di informazioni scure lampeggi a intermittenza in alto a destra nella vista della fotocamera.
Per l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle, o NTA, impostare la durata su 30 o 60 secondi e il numero di video su cinque. Per modificare il nome del file di base esistente, fare clic sulla scheda relativa a un nuovo sito di archiviazione per i dati generati con un nuovo nome file. Quindi selezionare la casella della temperatura di destinazione per inserire la temperatura desiderata e fare clic su Crea script per riutilizzare la misurazione standard.
Una volta caricato l'esempio e l'esperimento è pronto per l'esecuzione, fare clic su Crea ed esegui script. Nella schermata pop-up dei dettagli del report impostato, compilare i campi con le informazioni necessarie sull'operatore, sul campione e sul diluente. Quando tutti i campi desiderati sono stati compilati, fare clic su Impostazioni OK per avviare lo script.
Prima di ogni acquisizione video, cerca un prompt per far avanzare manualmente lo stantuffo. Iniettare circa 0,05 millilitri del campione nella camera laser. Quando le particelle si riposano, fare clic su OK. Al termine della quinta acquisizione video, verrà visualizzata una casella di conferma delle impostazioni insieme alla casella di processo.
Poiché i fotogrammi vengono avanzati manualmente dalla parte inferiore dello schermo video, annotare il numero di croci blu che creano particelle sullo schermo e impostare la soglia di rilevamento per l'elaborazione del campione. Attendi che i video vengano elaborati automaticamente in un istogramma dei risultati prima che venga visualizzata una notifica di completamento nella finestra di dialogo, quindi premi OK. Dopo aver visualizzato la casella delle impostazioni di esportazione, salvare i risultati facendo clic su Esporta. Evidenzia tutti e cinque i video di acquisizione elencati nell'esperimento corrente.
Quindi, fare clic su Elabora file selezionati e attendere che la casella di conferma dell'impostazione venga visualizzata nella casella di processo per lampeggiare per modificare la soglia di rilevamento, quindi regolare la soglia di rilevamento al livello desiderato e andare su Impostazione e fare clic su OK. I video verranno elaborati automaticamente in un istogramma dei risultati e verrà visualizzata una notifica di completamento nella finestra di dialogo. Fare clic OK.In l'analisi rappresentativa, vengono mostrati i risultati dell'analisi di nanotracking, o NTA, per i campioni di liposomi e un diluente DPBS rappresentativo. I campioni filtrati avevano un diametro medio delle particelle di 108 nanometri e una concentrazione di 7,4 volte 10 all'ottava particella per millilitro.
Al contrario, i campioni non filtrati avevano un diametro medio delle particelle di 159 nanometri e una concentrazione di 7,6 volte 10 all'ottava particella per millilitro. A livelli combinati di telecamere, poiché la soglia di rilevamento è stata aumentata da due a cinque, la dimensione media e modale delle particelle ha mostrato una significativa diminuzione delle dimensioni delle particelle dei campioni filtrati. Le concentrazioni di particelle a livelli combinati di telecamere sono diminuite con l'aumentare della soglia di rilevamento.
Non è stata rilevata alcuna differenza significativa nelle concentrazioni di particelle tra campioni filtrati e non filtrati. Alle soglie di rilevamento combinate, poiché il livello della telecamera è aumentato da 12 a 14, è stata osservata una diminuzione della dimensione media e modale delle particelle dei campioni filtrati. Le concentrazioni di particelle alle soglie di rilevamento combinate sono aumentate con l'aumentare dei livelli della telecamera da 12 a 14.
Non sono state osservate differenze significative tra campioni filtrati e non filtrati. I passaggi da 4.1 a 5.2 sono importanti per trovare l'area di visualizzazione corretta. Il raggiungimento di risultati coerenti in più cicli di prova dipende da questa abilità ripetibile.
La diffusione dinamica della luce viene spesso utilizzata come compagno dell'analisi di tracciamento delle nanoparticelle principalmente per ottenere il potenziale zeta, che è la carica superficiale delle particelle. Per l'analisi delle nanoparticelle, l'NTA continua ad essere un metodo molto prezioso di quantificazione delle particelle utile per la ricerca sulle vescicole extracellulari.
