The authors would like to thank Christina Ball&#225;zs, Hug Aubin and J&#246;rn H&#252;lsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.

REMARQUE: Les expériences présentées dans cet ouvrage ont été approuvés par le comité d&#39;éthique institutionnel de l&#39;Université de Düsseldorf. 1. Préparation Exosome <ol><li> Prélever le sang entier dans trois tubes de citrate par ponction veineuse (total de 9 ml). Verser le sang dans un tube Falcon de 15 ml. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 1 500 xg pendant 20 min à 4 ° C pour initier la séparation des cellules du plasma. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 15 ml de faucon. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 2800 g pendant 20 min à 4 ° C pour éliminer toutes les cellules du plasma (plasma acellulaire; PCP). Transférer la PCP à des tubes d&#39;ultracentrifugation, 1 ml par tube. </li><li> Centrifuger à 100 000 xg pendant 90 min à 4 ° C à épuiser exosomes. Retirer 900 pi de surnageant. Remettre en suspension le culot dans 100 pl les restant dans le tube d&#39;ultracentrifugation. Ajouter 900 ul de PBS. </li><li> Centrifuger à nouveau 100 000 xg pendant 30 min à 4 ° C. Retirer 900 pi de supernatant. Re-suspendre le culot avec les 100 pi restants. </li><li> Transfert 5-20 ul de remise en suspension dans 40 ml d&#39;eau distillée. Filtrer la suspension à travers un filtre de 450 nm à séparer exosomes de particules plus grosses. Utilisez cette suspension finale pour la mesure des particules. </li></ol> 2. Procédure de démarrage de l&#39;instrument de suivi des particules <ol><li> Lancez le programme en double-cliquant sur l&#39;icône du logiciel-. Cliquez sur les différents onglets de logiciels (&quot;Cell Check&quot;, &quot;Mesure&quot;, &quot;Analyse&quot;) pour basculer entre eux à travers le protocole. </li><li> Suivez les instructions à l&#39;écran pour une mise en oeuvre automatique de la procédure de démarrage. Cochez les cases à la fois pour le contrôle de qualité de la cellule et de l&#39;alignement automatique. NOTE: Chacune de ces étapes peuvent être répétées séparément si nécessaire par le bouton (A) ou (B) en appuyant sur l&#39;onglet &quot;contrôle de cellule&quot;. </li><li> Ouvrez l&#39;entrée et l&#39;orifice de sortie de l&#39;instrument NTA et injecter 10 ml d&#39;eau distillée avec une seringue dans le canal de la cellule à travers l&#39;orifice d&#39;entrée. Fermer l&#39;orifice de sortie comme la dernière quantité d&#39;eau est injectée. Placer un récipient sous l&#39;orifice de sortie pour recueillir la solution de déchets. Se assurer que la cellule de mesure est exempte de bulles d&#39;air et ne pas seringue bulles d&#39;air dans le système. Fermez immédiatement l&#39;orifice d&#39;entrée. </li><li> Effectuer le contrôle de la qualité de la cellule en cliquant sur &quot;OK&quot;. Le logiciel affiche les résultats de la qualité de cellule après quelques secondes. </li><li> Si les particules sont encore visualisées sur l&#39;écran Live View du logiciel ou si le résultat du contrôle de la qualité ne est bon ou mauvais, répétez l&#39;étape 2.3 jusqu&#39;à ce que les particules restantes sont retirés de la cellule de mesure. Répéter aussi l&#39;étape 2.3 après chaque mesure pour éviter l&#39;accumulation de particules. Si répéter l&#39;injection d&#39;eau distillée et le contrôle de la cellule ne produit pas un «bon» résultat, passez à 2,9. </li><li> Préparer une suspension uniforme de contrôle contenant 200 nm de taille polystyrene particules à être utilisés pour aligner les foyers du laser et microscope. Ajouter une goutte de la suspension concentrée, fournie par le fabricant de l&#39;instrument, à 500 ml d&#39;eau distillée pour obtenir la concentration requise de telle sorte que 600 ± 100 particules par écran sont affichées en temps réel dans la carte. </li><li> Injecter la suspension d&#39;alignement dans l&#39;instrument NTA comme décrit dans l&#39;étape 2.3. Appuyez sur &quot;OK&quot; pour démarrer l&#39;alignement automatique, une routine automatisée à travers lequel le système va automatiquement trouver la position optimale des deux foyers. </li><li> Quand un message apparaît indiquant que le système est maintenant prêt pour des expériences, cliquez sur OK pour démarrer la mesure. </li><li> Occasionnellement, nettoyer le canal de la cellule entre les expériences manuellement par rinçage de la cellule avec une solution à 30% d&#39;éthanol. Nettoyez le canal chaque fois que le logiciel affiche un rapport d&#39;erreur automatique. </li></ol> 3. Mesure de l&#39;échantillon <ol><li> Rincer le canal avec de l&#39;eau distillée avant eamesure de l&#39;échantillon ch (comme décrit à l&#39;étape 2.3). </li><li> Injecter la suspension de exosomes (préparé dans la section 1) pour le canal, comme décrit dans l&#39;étape 2.3. </li><li> Ajustez les principaux paramètres suivants dans le logiciel selon vos besoins: <ol><li> Sensibilité. Afin de trouver la plage de sensibilité optimale, cliquez sur le bouton &quot;nombre de particules par rapport Sensibilité&quot; pour afficher une courbe pour les particules mesurées par écran pour les différents niveaux de sensibilité. Choisir un niveau de sensibilité avant de la pente maximale de la courbe. Un niveau de sensibilité plus élevée permet la visualisation de petites particules plus mais augmente également les questions liées au bruit de fond. </li><li> Luminosité minimale. Choisissez un éclat de départ de 20 pour la mesure de exosome utiliser cette fonction comme un filtre. Réglementer ce paramètre jusqu&#39;à particules fortement la lumière de diffusion sur vierges. Réglementer le bas pour amplifier faiblement diffusant artefacts. Varier la luminosité au besoin tout au long de l&#39;expérience. NOTE: Les particules qui légersScatter trop fortement chevaucher et peuvent être exclues de l&#39;analyse par erreur. </li><li> Min et Max Taille. Définissez un filtre numérique pour éliminer le bruit de pixel et la dispersion indésirable de particules surdimensionnées en régulant la taille minimum et maximum. Utilisez une gamme de 10 à 500 pixels pour la mesure des exosomes. </li><li> Shutter. Régler la période de temps pendant laquelle l&#39;appareil est ouvert à 1/300 sec. </li></ol></li><li> Vivez paramètres lus: <ol><li> Basculer entre un appareil photo numérique et une vue modus analogique à tout moment en cliquant sur le bouton &quot;Live-image&quot;. </li><li> Tout au long de l&#39;expérience, surveiller la barre d&#39;intensité de diffusion, qui indique l&#39;état de saturation de l&#39;échantillon en tant qu&#39;indicateur de couleur codé. Ne pas analyser les exosomes si la barre de diffusion est rouge. Dans ce cas, diluer l&#39;échantillon afin d&#39;éviter ce phénomène. Si la condition expérimentale interdit une manipulation de la suspension de l&#39;échantillon, réguler à la baisse de la sensibilité ou de réguler à la hausse la luminosité dans le logiciel-settings pour améliorer les résultats de mesure. REMARQUE: Lorsque les échantillons avec une concentration extrêmement élevée de particules sont analysés la dispersion va fusionner particules individuelles et ils sont comptés comme une seule particule. </li><li> Notez le nombre de particules comptées dans le champ de vision de l&#39;écran. </li></ol></li><li> Cliquez sur l&#39;onglet &quot;Mesure&quot;. </li><li> Choisissez réglages dans le «options d&#39;exécution&quot; tableau. <ol><li> Avant chaque acquisition, sélectionnez «mouvement de contrôle» pour un test de la dérive des particules à cocher répétée. Effectuer le test au moins une fois avant de commencer toute l&#39;analyse. Si la dérive est supérieure à 20 um / sec, attendre avant de continuer la mesure de sorte que l&#39;échantillon se arrête de couler. </li><li> Sélectionner le nombre d&#39;expériences (5) et le retard temporel entre eux (0). </li><li> Effectuer un &quot;spécimen de chèque» si nécessaire. Ce test fait partie de l&#39;alignement automatique de la procédure de démarrage et peut être répétée après que nécessaire. </li&gt; </ol></li><li> Enfin, cliquez sur le bouton &quot;d&#39;acquisition vidéo de fonctionner&quot;. Dans la nouvelle fenêtre, définir le nombre de cycles (15) et le nombre de positions de mesure (11). REMARQUE: La tête de laser et du microscope peut être déplacé à analyser le nombre de particules à 11 positions différentes. Selon la demande expérimentale, décider si l&#39;expérience doit être effectuée sur une seule position ou sur différents postes. <ol><li> Confirmez la durée minimale d&#39;une particule doit être suivi doit être considérée comme une particule individuelle par la résolution de la vidéo (faible). A des résultats plus faibles de résolution dans une durée de suivi plus courte. </li><li> Sélectionnez un nom de fichier et cliquez sur &quot;OK&quot; pour démarrer la mesure. </li></ol></li></ol> 4. Interprétation des résultats <ol><li> Voir les résultats et les paramètres suivants affiche après la mesure sur l&#39;onglet &quot;Résultats&quot;: (1) le nombre total de particules tracées, (2) Nombre moyen d&#39;une partieicles par position, et (3) la concentration de particules. <ol><li> Voir le tableau résultat de la moyenne pour le rapport numérique de la taille des particules (diamètre, surface et volume) au pourcentage du nombre de particules, ainsi que les valeurs de la moyenne et de la différenciation standard. </li><li> Utiliser la table d&#39;analyse de crête si plus d&#39;un pic existe dans l&#39;analyse graphique. Ce tableau montre la répartition des particules plus petites que la première respectivement deuxième pic. </li></ol></li><li> Voir le graphique calculée après la mesure de voir une distribution de particules par taille. Utilisez les icônes dans le mode d&#39;affichage et au-dessus du graphique pour modifier les paramètres. </li></ol>

<ol>
	<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., Bonifacino, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.+Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.+.">Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. .</a> Current protocols in cell biology / editorial board. (3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling.">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).</li><li>Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> J. Vis. Exp. , e3037 (2012).</li><li>Konokhova, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-scattering+flow+cytometry+for+identification+and+characterization+of+blood+microparticles.">Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles.</a> Journal of biomedical. 17, 057006 (2012).</li><li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+current+knowledge+of+their+composition,+biological+functions,+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials.">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).</li><li>Sokolova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+exosomes+derived+from+human+cells+by+nanoparticle+tracking+analysis+and+scanning+electron+microscopy.">Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy.</a> Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).</li><li>Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antigen+presenting+cell+derived+exosomes,+based+on+immuno-magnetic+isolation+and+flow+cytometry.">Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry.</a> Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).</li><li>Carr, B., Warren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Company+profile:+NanoSight:+delivering+practical+solutions+for+biological+nanotechnology.">Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology.</a> Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).</li><li>Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma.">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> International immunology. 17, 879-887 (2005).</li></ol>

This work was supported by the institutional funds of the Dept. of Cardiovascular Surgery, Medical Faculty, HHU. The publication costs of this study were provided by Particle MetrixGmbH.

Nous démontrons un protocole détaillé pour l&#39;isolement exosomes du sang et du présent suivi de nanoparticules comme une méthode nouvelle et novatrice pour mesurer la taille et la concentration de exosomes dans un fluide biologique. Dans les expériences présentées sang périphérique humain a été utilisé comme origine des exosomes. Cependant, d&#39;autres origines, tels que l&#39;urine, le crachat, le surnageant de culture cellulaire, etc., peuvent également être utilisées comme matériau d&#39;essai. Basé sur la variabilité biologique de concentration exosomes chez les humains, les tests de différents individus peuvent présenter une concentration remarquable variable des exosomes. Cependant, la concentration de particules dans la sonde d&#39;essai biologique peut avoir un impact sur les résultats. Par conséquent, une approche fiable et normalisée de la dilution de sondes est nécessaire. Dans la méthode présentée exosomes contenant le plasma a été généré à partir de 9 ml de sang total périphérique. Par centrifugation différentielle étapes d&#39;une boulette de exosome été isolé à partir1 ml de plasma et remis en suspension dans 5 ml d&#39;eau distillée à entraîner dans l&#39;échantillon de travail des exosomes suspension. Ce paramètre de pré-défini nous a fourni avec une bonne concentration de particules, ce est à dire, l&#39;intensité de dispersion approprié pendant NTA. En plus de l&#39;aspect et du volume de dilution, la composition des solutions utilisées est également importante. Nous avons utilisé de l&#39;eau distillée pour la remise en suspension définitive des exosomes. Bien entendu, différents supports pour l&#39;étape de dilution finale peuvent également être utilisées, selon les exigences du montage expérimental. Toutefois, dans le cas de mesures du potentiel zêta de ioniques-solutions, en particulier lors de l&#39;essai des échantillons d&#39;une capacité de tamponnage, une dilution prudent dans des conditions libres de turbulence est utile. Pour la comparaison directe de plusieurs échantillons, nous recommandons de conserver le même niveau de dilution pour tous les échantillons. Tous les réglages, sauf la sensibilité et la résolution vidéo peuvent être modifiés par la suite en utilisant le logiciel d&#39;analyse ZETAview. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Bien que les auteurs estiment que le système mis en place de la présente représente actuellement l&#39;instrument le plus approprié, il ne est pas le seul système disponible NTA. Un certain nombre de rapports précédents ont employé d&#39;autres systèmes qui se appliquent les mêmes principes NTA mais fournissent une autre conception de l&#39;instrument qui va de pair avec quelques fonctionnalités différentes 10. Nous pensons que les aspects pratiques concernant la manipulation des échantillons et la reproductibilité des résultats sont d&#39;une importance capitale dans le choix de la séquence méthodologique pour l&#39;évaluation de exosomes. Nous pensons également qu&#39;un système de détection idéal devrait éliminer les facteurs selon l&#39;utilisateur qui peuvent interférer avec les résultats des mesures. L&#39;approche d&#39;analyse de exosomes qui est présentée ici répond au critère de la manipulation facile à un haut degré. Comme autre avantage, l&#39;analyse semi-automatisée des échantillons est réalisée dans un procédé rapide, générant des résultats dans un court laps de temps. Une visualisation en ligne des exosomes facilite l&#39;analyseur à gadans une idée instantanée des caractéristiques d&#39;exosomes, par exemple, la concentration brute. Un ajout très simple et élégante à la technique de mesure présenté ici est l&#39;utilisation d&#39;anticorps marqué et la capture des exosomes du faisceau laser dispersé en utilisant un filtre précédent devant le détecteur. De cette façon sous-populations d&#39;exosomes peuvent être distingués en fonction de leurs antigènes de surface et autres caractéristiques biologiquement pertinentes qui sont techniquement accessible à un coloration fluorescente sélective. Un inconvénient de la version actuelle de notre instrument de suivi des particules est le fait que, à des niveaux de sensibilité très élevée, tels que des artefacts de bruit de fond peuvent être présents, qui se appuie sur la paroi du canal de la cellule. Une solution technique et l&#39;amélioration du système actuel pourraient être disponibles dans un proche avenir. Par ce procédé, les réflexions de la lumière de dispersion laser sur la paroi du canal est réduit, augmentant ainsi<html> la précision des signaux de mesure et des données obtenues et de l&#39;abaissement de la limite de détection. Bien que le protocole actuellement utilisé pour l&#39;isolation des exosomes est bien établi et l&#39;instrument de suivi de particules appliqué a une résolution remarquablement précis avec une distribution de taille inférieure de 30 nm, il ne ya aucune garantie que les particules détectées sont en effet tout à fait vrai exosomes. D&#39;autres particules, telles que des fragments de cellules mortes ou des complexes protéiques plus grands peuvent également être présents dans la suspension d&#39;exosomes et conduire à des signaux faux positifs. Une méthode fiable par laquelle cette «pollution» peut être exclue peut être microscopie électronique (ME), soit de transmission EM EM ou balayage. Malheureusement, aucun marqueur général et spécifique pour exosomes a été identifié à ce jour, bien qu&#39;un certain nombre de marqueurs de surface proposées précédemment ont gagné une quantité croissante de l&#39;attention, y compris tétraspanine (Tspan), CD81, C63, CD9, etc. 11. &quot;&gt; Indépendamment de l&#39;évolution future de la recherche sur les exosomes biologie, notamment en matière de marqueurs spécifiques d&#39;exosomes, le protocole qui est présentée ici fournira une méthode puissante pour l&#39;isolement et la détection des exosomes. Concentration et la taille peuvent être facilement déterminées dans un logiciel assistée manière directe. L&#39;ajout de marqueurs fluorescents sélectifs ou des anticorps fluorophores couplé seront probablement améliorer encore les applications possibles de l&#39;approche présentée de NTA.

La fonction exacte des exosomes circulant restée inconnue pendant une longue période de temps. Même maintenant le mécanisme de chemin d&#39;accès complet des exosomes est pas entièrement comprise. Depuis exosomes portent des antigènes, des protéines et de l&#39;ARN (ARNm et des miRNA) qui les concerne leur cellule d&#39;origine des parents, leur fonction de cellule-cellule émetteurs de signalisation a essentiellement été donné la priorité. De nombreux procédés différents ont été décrits dans la littérature pour l&#39;isolement et la détection quantitative d&#39;exosomes 1,2. Toutefois, aucun consensus sur une «norme d&#39;or» a été atteint. Pendant ce temps la majorité des scientifiques actifs dans le domaine de la recherche exosomes conviennent qu&#39;une méthode cohérente de l&#39;isolement est fortement justifiée pour atteindre un plus haut degré de comparabilité entre les différents rapports et études. Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) est l&#39;outil le plus commun et répandu pour l&#39;analyse des exosomes 3. FACS a benEFIT que, par marquage par fluorescence, des cellules d&#39;origines différentes peuvent être comparés à une étape. Les inconvénients majeurs de FACS sont que cette méthode ne est pas assez sensible pour identifier les particules inférieures à 0,5 pm 4, tandis que les exosomes sont généralement comprises entre 30 à 120 nm de diamètre 5, encore moins de mesurer leur taille. La microscopie électronique à balayage (MEB) et microscopie électronique à transmission (MET) d&#39;autres outils d&#39;analyse de taille de particule et la morphologie des exosomes. Toutefois, les deux SEM et TEM ont l&#39;inconvénient que la préparation des échantillons est beaucoup de temps, les deux méthodes impliquent étapes de main-d&#39;œuvre et chacun a un risque de génération artefact. Ni méthode est adaptée pour un débit d&#39;échantillonnage élevée et la caractérisation de plusieurs milliers de particules individuelles d&#39;un échantillon. En outre, une analyse quantitative de routine quotidienne clinique où les échantillons doivent souvent être analysé simultanément ou au moins dans une très courte période estdifficile à réaliser. De nouvelles techniques de production nous permettent maintenant d&#39;analyser exosomes sans travaux préparatoires intensifs avant (SEM par exemple, de l&#39;environnement). Ces techniques modernes sont encore assez gênant pour l&#39;analyse de grandes suspensions de volume contenant exosomes afin de déterminer leur nombre moyen et la distribution de la taille 6. Une autre méthode très sensible pour la visualisation et l&#39;analyse des exosomes est l&#39;analyse de nanoparticules de suivi (NTA). Cette méthode tire parti de deux principes différents de la physique. Tout d&#39;abord, des particules sont détectées par la lumière diffusée quand ils sont irradiés avec un faisceau laser. Le second phénomène est appelé mouvement brownien, selon lequel la diffusion des différentes particules dans une suspension liquide est inversement proportionnelle à leur taille. Dans ce dernier cas, le mouvement dépend aussi de la température et de la viscosité du liquide. Cependant, ce taux est directement liée à la taille des particules et est utilisé par NTA. Utilisation douceanalyse basée-ware, des images numériques de la lumière diffusée par les particules simples sont enregistrées. Lots de taches lumineuses dispersées et leur vitesse de déplacement fournissent des données qui facilitent la détermination du nombre total des particules et la distribution granulométrique. Cette technique est particulièrement puissant pour l&#39;analyse des particules d&#39;un diamètre moyen inférieur à 100 nm. Taille et la concentration Les mesures sont effectuées avec le ZETAview brownien et Microscope Analyse électrophorèse Video Motion. Il se agit d&#39;un dessus de bureau nanoparticule instrument d&#39;analyse semi-automatique pour échantillons liquides (ci-après dénommé instrument de suivi des particules). Il se compose du suivi analyseur de particules ainsi que d&#39;un ordinateur portable avec le logiciel utilisé pour l&#39;analyse de données. Des échantillons biologiques hétérogènes sont comme convenant à ce procédé sous forme de suspensions homogènes de plus des particules inorganiques. Microscope de diffraction laser à l&#39;aide d&#39;une caméra vidéo est utilisée pour la détection de particules et de la observation de leur mouvement. Bien que l&#39;axe de microscope est horizontal et centré dans le canal de cellule remplie d&#39;une suspension contenant des exosomes, le faisceau laser est orienté verticalement. Les particules irradiés par la dispersion de la lumière laser, qui est enregistré sous 90 ° par une caméra vidéo numérique via le microscope (Figure 1). L&#39;intensité de la lumière diffusée permet l&#39;observation de particules de plus grand diamètre de 60 nm. Dans un tel réglage de la luminosité d&#39;une particule ne est pas la seule indication de la taille des particules. Si aucun champ électrique est appliqué, le mouvement des particules ne suit le mouvement brownien et peut servir d&#39;indicateur pour le calcul de la taille des particules. Cependant, l&#39;appareil est également capable d&#39;appliquer un champ électrique à travers le canal de la cellule. Lorsque soumis à ce champ, le potentiel, la polarité et le niveau de charge ionique des exosomes suspendus deviennent d&#39;autres déterminants de la direction de leur mouvement. Velocity et le résultat de direction dans un mo électrophorétiquebilité histogramme. Bien que la recherche d&#39;une méthode optimale pour analyser exosomes isolés ya un problème, un autre se trouve dans l&#39;isolement d&#39;exosomes efficace de différents supports, tels que le sang, l&#39;ascite, l&#39;urine, le lait, le liquide amniotique ou le support de la cellule. Différentes méthodes ont été décrites à ce jour, qui sont basées sur une ultracentrifugation, réactifs de séparation industriels (tels que Exoquick) 7, des billes magnétiques pour antigène employant séparation 8 ou 9 étapes ultrafiltration. Dans ce protocole, nous démontrons l&#39;ensemble du processus d&#39;isolement de exosomes par ultracentrifugation et montrons comment analyser l&#39;exosomes résultant contenant la suspension par l&#39;intermédiaire de l&#39;instrument de suivi de particules. Considérations particulières relatives à l&#39;analyse des exosomes dérivés de plasma moyennes ou de la culture de cellules humaines sont fournis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="645">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citrate tube</td>
			<td>BD</td>
			<td>364305</td>
			<td>BD Vacutainer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Distilled water</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3880087</td>
			<td>Aqua ad iniectabilia</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon tube</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>188271</td>
			<td>PP Tube, Steril 15ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultracentrifugation tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>357448</td>
			<td>Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybead</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>07304</td>
			<td>2,6% Solids-Latex 
			Alignment Solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (Filter)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617053V</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (ZetaView)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606051V</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305180</td>
			<td>BD Blunt Fill Needle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td>16555</td>
			<td>Syringe filter, hydrophilic, 450&#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Material Name&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>L8-M</td>
			<td>Rotor: 70Ti Ser. No E21078</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZetaView</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>PMX 100, Type 101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>Rotor: A-4-44</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an innovative method for exosome quantification and size measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

L&#39;échantillon utilisé pour cette démonstration montre un réglage optimal pour la mesure avec une sensibilité de 85%, avant de la pente maximale de la courbe de sensibilité (figure 2). La luminosité, le min / max des valeurs ont été choisis comme recommandé dans le protocole. Une concentration de 5,3 particules / ml x 10 6 a été mesurée, tandis que la taille moyenne des particules était de 0,149 um, la plupart d&#39;entre eux étaient 0,137 um. Les valeurs reçues après la mesure peuvent être enregistrées dans un rapport avec un format de fichier .pdf ou .txt pour l&#39;exportation dans une base de données. Le graphique peut être ajustée préféré comme décrit dans le protocole (article 4). La séquence vidéo est également enregistré et peut être utilisé pour plus tard hors ligne nouvelle analyse. Cependant, dans une telle analyse hors-ligne, les paramètres pré-acquisition de l&#39;appareil photo ne peuvent pas être modifiées rétrospectivement. Afin de trouver les paramètres optimaux pour une mesure, nous décrivons ici èmee optimisation des réglages de l&#39;appareil sur l&#39;exemple d&#39;un 100 nm de taille standard de polystyrène. L&#39;influence de deux paramètres, la sensibilité et min / max sur la distribution de taille d&#39;image vidéo et la taille des particules est discuté en détail. Tous les autres paramètres sont résumés dans le tableau 1. Une impression visuelle de l&#39;impact de la sensibilité (allant de 50 à 94) analogiques et numériques sur des images est visualisée sur la figure 3. Les informations quantitatives dérivée à partir des images est présentée en figure 4, en fonction des paramètres du tableau 1, Min = Taille 5 Taille et Max = 200. Une relation typique du nombre de particules détectées par rapport sensibilité est représenté sur la figure 4A. Entre 50 et 90, le nombre de particules détectées a augmenté avec sensibilité et augmenté de façon spectaculaire pour les sensibilités&gt; 90. Une gamme de sensibilité optimale a été observée entre 66 et 86 (A). les distributions de tailles des particules obtenues avec difréglages de sensibilité dif- sont montrés sur la figure 4B. Les distributions de taille de particule représentent la moyenne de trois mesures individuelles. Pour une sensibilité trop faible (sensibilité = 62, courbe rouge) à seulement quelques particules ont été analysés dans les statistiques résultant plutôt pauvres. Le nombre de particules analysées augmenté avec sensibilité et atteint un optimum entre 70 (courbe jaune) et 86 (courbe tan). Augmenter encore le fil de la sensibilité à une dégradation de la distribution de taille de particule avec le nombre de particules tombant et la distribution de taille de décalage vers des tailles plus petites (sensibilité = 94, la courbe bleue). La figure 4C montre l&#39;évolution du diamètre de x50 à base de nombre (50% les particules sont plus petites que ce diamètre) en fonction de la sensibilité. Dans l&#39;intervalle beige, le RSD de la taille des particules est inférieure à 8% et correspond à l&#39;intervalle optimal dans A. Les régions rouges indiquent RSD&gt; 8% à la suite de mauvaises statistiques (sensibilité trop bas) ou large distributions avec passage à de plus petites tailles (sensibilité trop élevée). Les réglages de Taille Min et Max Taille des filtres sont appliqués aux images numériques afin d&#39;éliminer les particules avec des tailles de spot inférieure à Min Taille et plus grand que Max Taille. En raison de la capacité à diffuser la lumière, une particule crée un endroit d&#39;une certaine taille sur une image numérique. La taille de la tache est mesurée en nombre de pixels (px). Quand une particule diffuse la lumière très bien (par exemple, les particules&gt; 200 nm ou d&#39;agrégats), la taille du spot est assez grand, par exemple,&gt; 500 px. La taille du spot est assez faible (par exemple, &lt;10 px) pour les petites particules (par exemple, &lt;20 nm) en fonction du matériau de particules. Taille du spot (px) ne peut pas être échangé avec la taille des particules (nm) car ils ne sont pas identiques et il n&#39;y a pas de relation directe entre ces deux variables. Une optimisation de Min et Max Taille permet à l&#39;utilisateur de filtrer les objets indésirables tels que des agglomérats (Max) ou petite tailleobjets tels que bruit de fond (Min Taille). L&#39;influence de Min / Max Taille de la distribution de taille de particule d&#39;une taille standard 100 nm est représentée sur la figure 4D (sensibilité = 82). Lorsque l&#39;intervalle est réglé sur petits spots (par exemple, min = 1, max = 52; courbe orange), le nombre de particules analysées est réduite et le diamètre de x50 à base de nombre est légèrement déplacée vers de plus petites tailles. Un cadre pour les taches plus grandes (min = 40, max = 1,000; courbe rouge) se traduit par une distribution de taille de particules large décalé vers de plus grandes tailles. Pour obtenir le nombre total égales de particules, les limites de l&#39;intervalle de deux distributions orange et rouge ont été ajustées pour correspondre à 80 particules. La distribution avec des paramètres optimaux (min = 5, max = 200; courbe tan) se compose de 360 ​​particules. Une série d&#39;expériences ont été effectuées avec succès exosomes isolées par ultracentrifugation et mesurées par le NTA en utilisant le système présenté. Les données résultantes ont été trèscohérente et confirmé un niveau élevé de reproductibilité. Autres méthodes d&#39;isolement doivent montrer des résultats similaires. Cependant, l&#39;étape de dilution a été identifié comme une étape particulièrement critique et son impact sur le nombre total de particules calculées doit être réévalué. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma de la configuration de la NTA. L&#39;axe de microscope / vidéo et le faisceau laser sont orientés orthogonalement par rapport à l&#39;autre, se croisant à la section transversale du canal de la cellule. La lumière diffusée par les particules est affiché dans le &quot;live-view&quot; fenêtre du logiciel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig1large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig2.jpg" /> <strong&gt; Figure 2. Nombre de particules par rapport courbe de sensibilité. Le nombre de particules par rapport courbe de sensibilité affiche les particules dans une position à un moment lors d&#39;une analyse automatique de la sensibilité. Cette visualisation graphique est utilisé pour déterminer les meilleurs choix concernant les mesures initiales. Une valeur de sensibilité est choisi avant la pente maximale de la courbe. Il est important de se rappeler que les artefacts ne sont pas éliminés dans cette expérience de test et peuvent affecter le graphique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig2large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig3.jpg" /> Figure 3. Impact de la sensibilité en mode analogique et de l&#39;image numérique. Visualisation des particules sur l&#39;écran en direct de vue se affiche pendant sensibilités entre 50 et 94 pour les deux analogique (rangée du haut) unD Digital (rangée du bas) vues. Lorsque la sensibilité est trop faible, à seulement quelques particules sont détectées (à gauche). Au sensibilité optimale les particules apparaissent comme des points simples et isolés les uns des autres (au milieu). À un particules de sensibilité relativement élevés fusionner conduisant à une mauvaise qualité d&#39;image (à droite). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig3large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig4.jpg" /> Figure 4. Influence de la sensibilité min et maxi de taille pour un échantillon contrôle à 100 nm de particules de polystyrène (A) Terrain de la sensibilité en fonction du nombre détecté de particules. l&#39;intervalle optimal est de 66 à 86, préalablement à la pente maximale de la courbe. Distributions (B) de la taille des particules obtenues avec plusieurs réglages de sensibilité (62-94); graphiques pour trop faible (62) ou trop haute (94) la sensibilité ne tiennent pas compte de la distribution de taille de particule de 100 nm échantillon témoin de polystyrène. (C) Nombre de diamètre sur la base de x50 par rapport à la sensibilité; l&#39;erreur de x50 dans l&#39;intervalle beige est inférieure à 8%, l&#39;intervalle optimal est de 66 à 86. (D) Effet de la taille minimum et maximum de la distribution de taille de particule; paramètres optimaux (min = 5 et max = 200) capturent la distribution correcte pour l&#39;échantillon de contrôle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig4large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Paramètres pré-acquisition </td></tr><tr><td> Sensibilité </td><td> variable </td></tr><tr><td> Obturateur </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Frame rate </td><td> 30 fps </td></tr><tr><td> Résolution </td><td> Salutgh </td></tr><tr><td> Cycles </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Acquisitions multiples </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Position </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="2"> Paramètres post-acquisition </td></tr><tr><td> Luminosité min </td><td> 30 </td></tr><tr><td> Max Taille </td><td> variable </td></tr><tr><td> Min Taille </td><td> variable </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Résumé des paramètres pré- et post-acquisition pour le réglage de l&#39;instrument de suivi de particules.

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An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Une méthode innovante pour Exosome Quantification et Taille Mesure

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

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Research

JoVE Journal

Biology

30.6K vues.  Heinrich-Heine-University Dusseldorf. A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

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Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Méthode pour la mesure de la cinétique de fusion virale au niveau particule unique

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Recherche

Biologie

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), and delta-cells (somatostatin) that are embedded in the exocrine tissues and comprise 1-2% of the entire pancreas. There is a close correlation between body and pancreas weight. Total beta-cell mass also increases proportionately to compensate for the demand for insulin in the body. What escapes this proportionate expansion is the size distribution of islets. Large animals such as humans share similar islet size distributions with mice, suggesting that this micro-organ has a certain size limit to be functional. The inability of large animal pancreata to generate proportionately larger islets is compensated for by an increase in the number of islets and by an increase in the proportion of larger islets in their overall islet size distribution. Furthermore, islets exhibit a striking plasticity in cellular composition and architecture among different species and also within the same species under various pathophysiological conditions. In the present study, we describe novel approaches for the analysis of biological image data in order to facilitate the automation of analytic processes, which allow for the analysis of large and heterogeneous data collections in the study of such dynamic biological processes and complex structures. Such studies have been hampered due to technical difficulties of unbiased sampling and generating large-scale data sets to precisely capture the complexity of biological processes of islet biology. Here we show methods to collect unbiased "representative" data within the limited availability of samples (or to minimize the sample collection) and the standard experimental settings, and to precisely analyze the complex three-dimensional structure of the islet. Computer-assisted automation allows for the collection and analysis of large-scale data sets and also assures unbiased interpretation of the data. Furthermore, the precise quantification of islet size distribution and spatial coordinates (i.e. X, Y, Z-positions) not only leads to an accurate visualization of pancreatic islet structure and composition, but also allows us to identify patterns during development and adaptation to altering conditions through mathematical modeling. The methods developed in this study are applicable to studies of many other systems and organisms as well.

Novel computer-assisted methods of large-scale procurement and analysis of immunohistochemically stained pancreatic specimens are described: (1) Virtual Slice capture of the entire section; (2) Mass analysis of large-scale data; (3) Reconstruction of 2D Virtual Slices; (4) 3D islet mapping; and (5) Mathematical analysis.

Assistée par ordinateur à grande échelle de visualisation et quantification de la messe des îlots pancréatiques, distribution de taille et d&#39;architecture

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

Simple reconstruction microscopie électronique de particules du complexe Exosome Utilisation de la méthode aléatoire Tilt conique

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Tangential Flow Ultrafiltration: A  &ldquo;Green&rdquo; Method for the Size Selection and Concentration of Colloidal Silver Nanoparticles

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to their powerful antimicrobial properties.3-6 These nanoparticle applications are strongly influenced by the AgNP size and aggregation state. Many challenges exist in the controlled fabrication7 and size-based isolation4,8 of unfunctionalized, homogenous AgNPs that are free from chemically aggressive capping/stabilizing agents or organic solvents.7-13 Limitations emerge from the toxicity of reagents, high costs or reduced efficiency of the AgNP synthesis or isolation methods (e.g., centrifugation, size-dependent solubility, size-exclusion chromatography, etc.).10,14-18 To overcome this, we recently showed that TFU permits greater control over the size, concentration and aggregation state of Creighton AgNPs (300 ml of 15.3 &mu;g ml-1 down to 10 ml of 198.7 &mu;g ml-1) than conventional methods of isolation such as ultracentrifugation.19
TFU is a recirculation method commonly used for the weight-based isolation of proteins, viruses and cells.20,21 Briefly, the liquid sample is passed through a series of hollow fiber membranes with pore size ranging from 1,000 kD to 10 kD. Smaller suspended or dissolved constituents in the sample will pass through the porous barrier together with the solvent (filtrate), while the larger constituents are retained (retentate). TFU may be considered a "green" method as it neither damages the sample nor requires additional solvent to eliminate toxic excess reagents and byproducts. Furthermore, TFU may be applied to a large variety of nanoparticles as both hydrophobic and hydrophilic filters are available.
The two main objectives of this study were: 1) to illustrate the experimental aspects of the TFU approach through an invited video experience and 2) to demonstrate the feasibility of the TFU method for larger volumes of colloidal nanoparticles and smaller volumes of retentate. First, unfuctionalized AgNPs (4 L, 15.2 &mu;g ml-1) were synthesized using the well-established Creighton method22,23 by the reduction of AgNO3 with NaBH4. AgNP polydispersity was then minimized via a 3-step TFU using a 50-nm filter (460 cm2) to remove AgNPs and AgNP-aggregates larger than 50 nm, followed by two 100-kD (200 cm2 and 20 cm2) filters to concentrate the AgNPs. Representative samples were characterized using transmission electron microscopy, UV-Vis absorption spectrophotometry, Raman spectroscopy, and inductively coupled plasma optical emission spectroscopy. The final retentate consisted of highly concentrated (4 ml, 8,539.9 &mu;g ml-1) yet lowly aggregated and homogeneous AgNPs of 1-20 nm in diameter. This corresponds to a silver concentration yield of about 62%.

Tangential Flow Ultrafiltration: A  &amp;ldquo;Green&amp;rdquo; Method for the Size Selection and Concentration of Colloidal Silver Nanoparticles

Tangential flow ultrafiltration (TFU) is a recirculation method used for the weight-based separation of biosamples. TFU was adapted to size-select (1-20 nm diameter) and highly concentrate a large volume of polydisperse silver nanoparticles (4 L of 15.2 &mu;g ml-1 down to 4 ml of 8,539.9 &mu;g ml-1) with minimal aggregation.

L&#39;ultrafiltration à flux tangentiel: Un &quot;Green&quot; Méthode de sélection Taille et concentration des nanoparticules d&#39;argent colloïdal

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Une méthode améliorée pour la mesure précise et rapide des performances de vol en<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&amp;#8217;s Esophagus Cells

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

Une méthode d&#39;immunofluorescence pour la caractérisation des cellules oesophage de Barrett

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

Une méthode facile pour des plantes polysomes Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. Three-dimensional (3D) cell culture techniques are a recent innovation developed to address the shortcomings of adherent cell culture. While several techniques for generating tissue analogues in vitro have been developed, these methods are frequently complex, expensive to establish, require specialized equipment, and are generally limited by compatibility with only certain cell types. Here, we describe a rapid and flexible protocol for aggregating cells into multicellular 3D spheroids of consistent size that is compatible with growth of a variety of tumor and normal cell lines. We utilize varying concentrations of serum and methyl cellulose (MC) to promote anchorage-independent spheroid generation and prevent the formation of cell monolayers in a highly reproducible manner. Optimal conditions for individual cell lines can be achieved by adjusting MC or serum concentrations in the spheroid formation medium. The 3D spheroids generated can be collected for use in a wide range of applications, including cell signaling or gene expression studies, candidate drug screening, or in the study of cellular processes such as tumor cell invasion and migration. The protocol is also readily adapted to generate clonal spheroids from single cells, and can be adapted to assess anchorage-independent growth and anoikis-resistance. Overall, our protocol provides an easily modifiable method for generating and utilizing 3D cell spheroids in order to recapitulate the 3D microenvironment of tissues and model the in vivo growth of normal and tumor cells.

Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.

Une méthode d&#39;agrégation cellulaire efficace et flexible pour 3D Spheroid production

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: une méthode à grande échelle pour la quantification multiparamétrique de la croissance de la levure

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Mise en place d’un pH extracellulaire acide système de Culture

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...