La stabilité de stockage des vésicules cellulaires supplémentaires est un paramètre important pour leur utilisation thérapeutique prospective. Notre protocole fournit un outil facilement applicable pour évaluer comment le stockage a des effets sur les vésicules. Le principal avantage de notre technique est qu’en introduisant la glucuronidase comme marqueur exogène, les vésicules extracellulaires dérivées de différentes cellules mères sont facilement comparées en ce qui concerne leur storabilité.
La fractionnement asymétrique du débit du champ d’écoulement, ou AF4, est une alternative douce à la purification de la chromatographie d’exclusion de taille pour les composés très sensibles. Parce que les composés rencontrent moins de stress dans le canal. Comme la glucuronidase est une enzyme sensible, la qualité de la réside bénéficie d’une planification approfondie et la réalisation des étapes pour la purification et l’analyse dos à dos.
Après avoir cultivé la ligne d’intérêt cellulaire selon les conditions standard pour ces cellules, remplacer le supernatant par du sérum libre ou extra cellulaire vésicule épuisé moyen et retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pour un supplément de 24 à 72 heures. À la fin de l’incubation, recueillir le super natant de chaque flacon et centrifuger les échantillons pour sédimenter les cellules. Recueillir soigneusement le milieu conditionné de la cellule sans déranger la pastille.
Et centrifuger le milieu à nouveau pour enlever les débris cellulaires et les gros agrégats. Ensuite, transférez soigneusement les supernatants dans des tubes d’ultracentrifugeuse. Si vous utilisez un rotor à angle fixe, marquez l’orientation des tubes dans la centrifugeuse pour faciliter la récupération de la pastille de vésicule extracellulaire après la centrifugation.
À la fin de l’ultracentrifugation, utilisez une pipette sérologique pour jeter soigneusement le supernatant sans perturber la pastille de vésicule extracellulaire. À 200 microlitres de 0,2 micromètre pore filtré PBS au supernatant résiduel du premier tube d’ultracentrifugeuse. Après avoir resuspendu la pastille, transférez la suspension de vésicule extracellulaire résultante au tube suivant pour la résuspension de la pastille suivante jusqu’à ce que toutes les granules de vésicule extracellulaire aient été résuspendus.
Ajouter la bêta-glucuronidase à la solution finale de granulés résuspendus à une concentration finale de 1,5 milligramme par millilitre. Et la saponine à une concentration finale de 0,1 milligramme par millilitre. Mélangez ensuite bien en tourbillonnant pendant trois secondes et placez la réaction à température ambiante pendant 10 minutes avec un scintillement doux intermittent.
Une fois que le glucuronidase a été encapsulé, assurez-vous d’effectuer toutes les étapes suivantes d’évaluation vésicule de purification le même jour pour obtenir des résultats impartiaux de stabilité de stockage. Avoir une colonne de chromatographie d’exclusion de taille équilibrée avec au moins deux volumes de colonne de PBS prêts à purifier la pastille immédiatement après l’incubation de saponine. Pour purifier, ajouter jusqu’à 400 microlitres de suspension vésicule extracellulaire à la colonne.
Puis recueillir une fraction millilitre de l’allongement. Pour se conformer à la séparation des vésicules extracellulaires des protéines contaminantes et de la glucuronidase libre, mesurez la concentration en protéines par analyse d’acide bicinchoninique selon les instructions des fabricants. À l’aide de paramètres optimisés pour le type d’instrument et de vésicule respectifs, utilisez un instrument d’analyse du suivi des nanoparticules pour mesurer la taille et la concentration extracellulaires des vésicules.
Pour mesurer l’activité de la glucuronidase, ajouter 25 microlitres de fluorescine di-bêta-D-glucuronide fraîchement préparé à 125 microlitres des vésicules extracellulaires purifiées et ajouter l’échantillon à un puits d’une plaque noire de 96 puits. Mesurez le temps de production zéro fluoréscine sur un lecteur de plaque à une excitation de 480 nanomètres et une émission de 516 nanomètres. Couvrir hermétiquement la plaque de papier d’aluminium transparent pour réduire l’évaporation.
Puis incuber la plaque protégée de la lumière pendant 18 heures à 37 degrés Celsius. Mesurez la production de fluorescine de 18 heures sur le lecteur de plaque comme nous venons de le démontrer. Pour la lyophilisation extracellulaire de vésicule, ajoutez quatre milligrammes par millilitre de tréhalose aux vésicules purifiées.
Et congeler les vésicules à moins 80 degrés Celsius pendant au moins une heure. Pour lyophiliser les échantillons, réglez la température de conservation d’un lyophilisateur à 15 degrés Celsius et la pression à 0,180 millibars. Séchez les vésicules dans ces conditions pendant 46 heures.
À la fin de l’étape de séchage principale, réglez la température du plateau à 25 degrés Celsius et la pression à 0035 millibars et séchez les échantillons pendant deux heures dans ces conditions. Rangez ensuite les échantillons lyophilisés à quatre degrés Celsius. Pour réhydrater les échantillons après stockage, ajouter un volume d’eau égal au volume de la suspension vésicule extracellulaire avant la lyophilisation.
Pour évaluer l’activité enzymatique après stockage, chargez un instrument AF4 avec du PBS filtré de 0,1 micromètre fraîchement préparé pour la phase mobile et insérez une membrane filtrante de 0,1 micromètre dans le filtre à entrées de pointe après la pompe pour réduire le bruit des particules du solvant. Après le démontage, nettoyer le petit canal pour AF4 avec de l’eau millEq. Hydratez une nouvelle membrane de cellulose régénérée avec un poids moléculaire coupé de 30 kilodaltons et placez la membrane sur le dessus de la frette avec le côté brillant vers le haut.
Placez un large espaceur de 350 micromètres sous la moitié supérieure du canal et assemblez les parties du canal. À l’aide d’un tournevis de couple, serrer les vis d’abord à un couple de cinq mètres Newton, puis à un couple de sept mètres Newton. Serrant les vis autour du bloc dans un modèle sillonné.
Connectez l’entrée des canaux, la sortie et le port de flux transbordement à l’éclipse. Puis à partir d’au moins trois vieux échantillons pour équilibrer la membrane. Programmez une fractionnement avec le flux du détecteur et le flux de mise au point réglé à un millilitre par minute et un débit d’injection de 0,2 millilitres par minute.
Après une étape de pré-focalisation d’une minute, injecter l’échantillon sur une période de 10 minutes dans la mise au point et injecter l’étape, avant de diminuer le flux de croix de deux millilitres par minute à 0,1 millilitres par minute au cours de huit minutes. Terminer la course de fractionnement avec une étape d’élitution sans écoulement croisé pendant 10 minutes et ajouter une étape de lavage de l’élitution et l’injection, suivie d’une élitution. Ensuite, équilibrer le canal pour la prochaine course avec un flux de croix initiale de deux millilitres par minute et régler le détecteur UV à 280 nanomètres.
Lorsque tous les programmes ont été définis, injectez 300 microlitres de l’échantillon et enregistrez les signaux de diffusion UV et lumineux dans le logiciel ASTRA. Après 12 minutes et demie, commencer à recueillir une fraction millilitre jusqu’à 27 minutes après l’injection. Effectuez ensuite un test de glucuronidase et une analyse de suivi des nanoparticules comme démontré.
Ici, la récupération des particules et la taille des vésicules extracellulaires isolées des cellules endothéliales vasculaires humaines après sept jours de stockage dans des conditions différentes sont montrées par rapport à un échantillon frais. Des vésicules ont été plus tard soumises à la purification d’AF4 et l’activité de glucuronidase par particule a été mesurée. La chromatographie d’exclusion de taille et AF4 réussissent à séparer la vésicule extracellulaire de la glucuronidase libre.
En raison du degré plus élevé de séparation de l’AF4 entre les particules et l’enzyme libre, la contamination des fractions contenant des vésicules est moins probable. La purification AF4 après stockage élimine l’enzyme libre des échantillons et réduit ainsi la quantité d’activité enzymatique récupérée par particule. Cet effet est plus important après stockage à quatre degrés Celsius, pour lequel une réduction de 2/3 est observée.
Omettre cette étape de purification supplémentaire peut conduire à une mauvaise hypothèse sur la stabilité de l’enzyme. La microscopie électronique de transmission ne révèle pas de grandes différences de forme pour les vésicules extracellulaires lyophilisées sans cryoprotecteur. La microscopie électronique à balayage révèle toutefois la présence d’agrégats dans les échantillons lyophilisés qui ne se trouvent pas dans les échantillons stockés à moins 80 degrés.
Il est crucial que l’enzyme libre soit enlevée des vésicules avant l’essai de glucuronidase. Ainsi, la technique utilisée pour la purification vésicule doit être soigneusement évaluée. Les particules purifiées pourraient également être examinées en fonction de leur charge de surface pour savoir si le stockage a modifié la composition naturelle des protéines membranaires ou des sucres.
Avec notre technique, il est possible d’obtenir une première indication sur la stabilité extracellulaire de stockage vésiculeux, même lorsqu’il n’y a pas de marqueurs spécifiques connus ou d’analyses pour l’activité disponible.
