La NASH est l’une des maladies chroniques du foie les plus importantes au monde. Il peut évoluer vers la fibrose, la cirrhose et éventuellement le cancer du foie. Étudier le changement dynamique de l’ECM dans la NASH peut aider à mieux comprendre la fibrose.
L’imagerie traditionnelle ne peut pas démontrer les changements de structure ECM 3D, ce qui limite la compréhension du processus de remodelage ECM dynamique dans la fibrose hépatique. Pour commencer, pesez la souris avant la procédure. Après avoir anesthésié, la souris rase la région ventrale à l’aide d’une tondeuse à cheveux et désinfecte la peau avec de l’éthanol à 70%.
Placez la souris sur son dos et immobilisez les jambes sur la planche chirurgicale avec du ruban adhésif. Utilisez des ciseaux Mayo et des pinces Adson pour faire une incision latérale de trois centimètres dans le bas-ventre. Et puis une incision de cinq centimètres verticalement du bas-ventre au processus xiphoïde sans ouvrir la cavité thoracique.
Après avoir ouvert le péritoine, placez doucement les intestins à gauche de l’animal et élevez le lobe droit du foie avec un applicateur à pointe de rayonne pour exposer la veine porte. Pour cathétériser la veine porte, induisez un cathéter IV de calibre 24 dans l’extrémité distale de la veine porte. Placez l’embout du cathéter avant que la veine porte ne se ramifie dans les lobes hépatiques.
Retirez l’aiguille immédiatement lorsque le cathéter pénètre dans la veine. Vérifiez que le cathéter est correctement positionné à l’intérieur de la veine en perfusant le foie avec du PBS à l’aide d’une seringue d’un millilitre via le cathéter. Utilisez des micro-pinces Dumont, une micro-aiguille Castroviejo et une suture 4-0 pour placer un point sous la ramification de la veine porte et un deuxième point un centimètre plus bas pour fixer le cathéter.
Connectez le cathéter à un tube en silicone d’un mètre de longueur, de trois millimètres de diamètre intérieur et de 4,1 millimètres de diamètre extérieur avec un connecteur de leurre. Connectez le tube en silicone à une pompe péristaltique et à un réservoir contenant de l’eau désionisée. Retirez soigneusement les bulles d’air à l’intérieur du tube et évitez de générer de nouvelles bulles pendant la perfusion.
Réglez la pompe péristaltique à un débit de 0,2 millilitre par minute. Lisez d’abord avec de l’eau désionisée pendant deux heures et la couleur du foie passera du rouge au jaune pendant la perfusion. Basculez la solution de perfusion en désoxycholate de sodium à 0,5% et continuez pendant la nuit et le foie deviendra blanc à la fin de la perfusion.
Basculez la solution de perfusion dans de l’eau désionisée et perfusez pendant deux heures. Utilisez des micro-pinces Dumont et des ciseaux à ressort micros pour recueillir le foie décellularisé et le laver soigneusement dans une boîte de Petri avec du PBS. Transférez un petit morceau de foie décellularisé sur une lame de microscope et placez le tissu au milieu.
Ajoutez 10 microlitres de support de montage antidécoloration au mouchoir avec une pipette pour éviter le dessèchement des tissus. Couvrez le tissu avec un verre de couverture et appliquez une petite force pour aplatir l’échantillon. Scellez les bords du verre de couverture avec du vernis à ongles incolore et transparent.
Placez une goutte d’huile d’immersion sur le dessus du verre de couverture et placez la lame sur le support de lame du microscope. Abaissez la lentille d’objectif d’huile 20X jusqu’à ce qu’elle entre en contact avec l’huile d’immersion. Passez au canal violet de longueur d’onde 405 nanomètres.
Allumez l’obturateur et concentrez l’échantillon. Naviguez et positionnez la zone d’intérêt pour l’imagerie. Éteignez l’obturateur avant de passer à l’acquisition d’image à l’aide de la lumière laser.
Pour démarrer le laser à deux photons, passez à la commande de l’ordinateur et allumez d’abord le laser à deux photons. Allumez ensuite le contrôleur laser à deux photons et l’obturateur en vous assurant que la puissance de sortie est supérieure à 2,5 watts. Réduisez la puissance du laser pour éviter la trempe de fluorescence.
Sélectionnez et ajustez les détecteurs à la fois les photomultiplicateurs et l’hybride pour s’adapter aux fluorophores choisis. Choisissez des acquisitions d’images simultanées ou séquentielles. Ajustez le trou d’épingle à la valeur la plus élevée.
Ajustez les longueurs d’onde laser, le gain, la puissance, le décalage du temps d’arrêt des pixels, la moyenne de la taille des pixels et le zoom. Faites défiler le contrôleur Z de l’ordinateur et définissez les dimensions Z. Définissez le début et les points de terminaison et choisissez le nombre d’images fournies dans un volume.
Acquérir des images. Après avoir effectué la microscopie à deux photons, les fibres de collagène sans décellularisation ont révélé une image à basse résolution du réseau de collagène. Dans la matrice extracellulaire décellularisée, des différences apparentes ont été observées dans la morphologie et la distribution spatiale entre les foies de chow et de restauration rapide.
Les fibres de collagène et les souris suivant un régime chow présentaient un réseau entrelacé et bien organisé, tandis que les souris suivant un régime de restauration rapide présentaient des faisceaux de collagène avec moins de connectivité. La structure tridimensionnelle de la matrice extracellulaire du foie montre que les fibres de collagène chez les souris suivant le régime chow ont montré un réseau bien organisé, mais pas chez les souris de restauration rapide. Pour confirmer la qualité du collagène fibrillaire dans la matrice extracellulaire décellularisée, les lames ont été colorées avec de l’hématoxyline éosine et du rouge Picrosirius.
L’hématoxyline et l’éosine montrent que toutes les cellules ont été enlevées. Dans les images de coloration rouge de Picrosirius, la matrice extracellulaire des souris nourries au chow a révélé un réseau bien organisé. Et en revanche, les souris suivant un régime de restauration rapide ont montré des fibres de collagène plus denses.
Retirez délicatement la bulle à l’intérieur d’un tube avant la perfusion. La bulle bloquera le vaisseau dans le foie et affectera la perfusion.
