Cette recherche a été financée par des fonds nationaux et européens via la Fondation portugaise pour la science et la technologie (FCT), le Fonds européen de développement régional (FEDER) et le Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) et POCI-01-0145-FEDER-007440. Les auteurs tiennent à remercier iLAB - Microscopy and Bioimaging Lab, une installation de la Faculté de médecine de l’Université de Coimbra et membre de l’infrastructure nationale PPBI-Plateforme portugaise de bioimagerie (POCI-01-0145-FEDER-022122), ainsi que le soutien de FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.

Toutes les procédures animales effectuées dans cette étude ont été approuvées par l’organisme de protection des animaux de l’Institut de recherche clinique et biomédicale de Coimbra (IBRC) (ORBEA, #9/2018) et étaient conformes aux directives nationales et européennes sur les soins aux animaux et aux directives ARRIVE.
1. Conception expérimentale
<ol><li>Couple de rats Wistar mâles âgés de 13 semaines dans des cages ventilées dans des conditions environnementales contrôlées de température (22 °C ± 1 °C), d’humidité (50 % à 60 %) et de lumière (cycle lumière-obscurité de 12 h) et avec accès ad libitum à l’eau du robinet et à la nourriture standard pour rongeurs.</li>
	<li>Après une période d’acclimatation de 2 semaines, assignez arbitrairement les rats en deux groupes.</li>
	<li>Nourrissez les groupes témoins (CTRL, n = 6) et riches en graisses (HFD, n = 6) avec un régime standard et un régime riche en graisses (45% kcal / gras), respectivement, pendant 24 semaines.</li>
	<li>Surveillez le poids corporel (PC) chaque semaine. Consigner la consommation quotidienne d’aliments et de boissons par cage.</li>
</ol>2. Préparation de l’échantillon de foie
<ol><li>Curage hépatique<ol><li>Préparez la pompe péristaltique : Faites passer de l’éthanol à 70 % dans le tube, connectez une aiguille de 27 G à l’extrémité de sortie du tube et amorcez le tube avec une solution saline glacée (4 °C) 1x tamponnée au phosphate (PBS, pH ~ 7,4 ) (p. ex., 200 tr/min sur une pompe péristaltique avec un tube en silicium I.D. de 1,6 mm, un mini jeu de perfusion IV). Ajuster en fonction du poids corporel (p. ex., pour un rat de 100 à 150 g, utiliser un débit d’environ 10 à 12 mL/min).</li>
		<li>Anesthésier le rat par injection intrapéritonéale à l’aide d’un protocole d’anesthésie (concentration finale de kétamine = 75 mg/kg, et concentration finale de médétomidine = 1 mg/kg). REMARQUE: Assurez-vous que le rat est complètement anesthésié à l’aide de la méthode de réponse par pincement des orteils.</li>
		<li>Placez le rat sur le plateau de dissection.</li>
		<li>Désinfectez soigneusement la fourrure avec de l’éthanol à 70% et séchez-la avec une serviette en papier.</li>
		<li>À l’aide de ciseaux, faites une incision en forme de « U » à travers la peau et coupez sous le diaphragme. Ensuite, coupez la cage thoracique rostralement sur les bords pour exposer le cœur.</li>
		<li>Pendant que le PBS 1x fonctionne, passez l’aiguille à travers le ventricule gauche dans l’aorte ascendante et serrez. Ensuite, l’oreillette droite est coupée pour permettre le drainage une fois la perfusion commencée. REMARQUE: Le foie devrait commencer à blanchir car le sang est remplacé par du PBS.</li>
		<li>À l’aide de ciseaux et de pinces Dumont, retirez soigneusement le foie et rincez avec 1x PBS.</li>
		<li>Transférer le foie sur une boîte de Petri et peser.</li>
		<li>À l’aide d’un scalpel, prélever des échantillons de tissu hépatique de 5 mm d’épaisseur du côté latéral (1 cm du bord) du lobe gauche du foie pour le processus d’enrobage. NOTE Les tissus restants peuvent être conservés à −80 °C pour un stockage à long terme.</li>
	</ol></li>
	<li>Intégration du tissu hépatique<ol><li>Préparez un récipient de glace carbonique et étiquetez correctement les cryomoules avec l’ID et l’orientation de l’échantillon.</li>
		<li>Placez quelques gouttes de cryo-matrice d’incorporation sur le centre du cryomoule pour obtenir la température de coupe optimale (OCT).</li>
		<li>Assurez-vous que l’échantillon de tissu est correctement orienté pour une section transversale. REMARQUE: Assurez-vous que le côté touchant le fond du cryomoule est le côté qui sera sectionné en premier.</li>
		<li>Déposez délicatement plus d’OCT sur le cryomoule jusqu’à ce qu’il soit complètement recouvert. Essayez d’éviter la formation de bulles d’air. Si nécessaire, à l’aide d’une pince ordinaire, retirez les bulles à l’intérieur de l’OCT.</li>
		<li>Placez rapidement le cryomoule avec l’échantillon recouvert d’OCT dans un récipient de glace carbonique. REMARQUE: Les tissus peuvent être conservés à -80 ° C pendant 3 ans.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Sectionnement de tissus congelés
<ol><li>Ajustez la température du cryostat (chambre : −21 °C ; échantillon : −18 °C) et insérez une nouvelle lame stérile.</li>
	<li>Placez les échantillons dans le cryostat pendant 30 minutes avant de laisser la température s’équilibrer.</li>
	<li>Faire une seule couche de TCO sur le disque de l’échantillon pour permettre l’adhésion de l’échantillon. Laissez l’OCT geler et montez l’échantillon de tissu dans l’orientation souhaitée. REMARQUE: La surface de coupe doit être parallèle à la lame. Pour maintenir une bonne adhérence, placez l’extracteur de chaleur sur le dessus de l’échantillon. Les étapes précédentes peuvent également être effectuées dans un récipient de glace carbonique avec de la glace sèche.</li>
	<li>Placez l’échantillon dans la tête de l’échantillon et coupez la surface du tissu (quelques sections d’échantillon de tissu de 30 μm).</li>
	<li>Une fois que la région d’intérêt est accessible pour le sectionnement, coupez des sections de 12 μm d’épaisseur et placez-les sur des lames de microscope étiquetées conservées à température ambiante (RT). REMARQUE: Pour recueillir la section, déplacez lentement la lame vers la section de tissu. Chaque lame peut recueillir deux sections de foie.</li>
	<li>Laisser sécher les lames pendant 10 min à la RT. REMARQUE: Les lames peuvent être conservées à -20 ° C pendant 6 à 12 mois ou à -80 ° C pendant 3 ans maximum.</li>
</ol>4. Coloration BODIPY
<ol><li>Décongeler les lames dans un système de coloration de glissière à TA pendant 30 min.</li>
	<li>Laver avec 1x PBS (3x pendant 5 min chacun).</li>
	<li>Encerclez la section avec une couche hydrophobe à l’aide d’un stylo-barrière.</li>
	<li>Préparer 500 μg/mL de solution mère BODIPY 493/503 : Dissoudre 1 mg de BODIPY 493/503 dans 2 mL de solvant (90 % de DMSO; 10 % 1x PBS). Protéger de la lumière. Sonifier dans un bain à ultrasons pendant 1 h (9,5-10 W) à 37 °C. REMARQUE: La solution peut être conservée à -20 ° C pendant au moins 30 jours.</li>
	<li>Préparer la solution de coloration BODIPY (1 μg/mL) en ajoutant 2 μL de solution mère BODIPY 493/503 et 0,1 μL de solution mère DAPI (5 mg/mL) à 997,9 μL de 1x PBS.</li>
	<li>Incuber les lames (75 μL/lame) avec BODIPY 493/503 (1 μg/mL) et DAPI (0,1 μg/mL) à TA pendant 40 min. REMARQUE: Gardez les diapositives dans l’obscurité à partir de cette étape.</li>
	<li>Lavez les lames avec 1x PBS (3x pendant 5 min chacune).</li>
	<li>Montez les lames avec des lamelles de couverture à l’aide d’un support de montage à fluorescence, laissez-les sécher pendant 30 minutes et scellez-les avec du vernis à ongles. REMARQUE: Les diapositives peuvent être stockées à 4 ° C jusqu’à l’imagerie.</li>
</ol>5. Quantification des lipides
<ol><li>Mesurer les taux sériques de cholestérol total et de TG à l’aide d’une méthode et d’un équipement automatiques et validés.</li>
	<li>Mesurer les taux de TG hépatiques à l’aide d’un kit de dosage colorimétrique des triglycérides (Tableau des matériaux) selon le protocole du fabricant.</li>
</ol>6. Acquisition d’images
<ol><li>Placez la lame sur le support de lame de microscope confocal à balayage laser.</li>
	<li>Pour la visualisation et l’acquisition d’images, utilisez un microscope confocal avec une lentille d’objectif 20x (plan-apochromate : 20x/0,8).</li>
	<li>Pour éviter la diaphonie entre le BODIPY 493/503 et le DAPI, utilisez le mode de balayage séquentiel (meilleur signal) sur le logiciel confocale.</li>
	<li>Excitez le BODIPY 593/503 en utilisant la ligne laser argon 488 nm et le DAPI en utilisant la ligne laser 405 nm. Définissez les plages d’émission à 493-589 nm pour BODIPY 493/503 et à 410-464 nm pour DAPI.</li>
	<li>Utilisez les paramètres suivants : sténopé : 1 UA, résolution : 1 024 pixels x 1 024 pixels, profondeur de bits : 12, taille des pixels : 0,415 μm, mode bidirectionnel, vitesse de balayage : 7 (~1,58 μs/pixel pour un objectif 20x), moyenne linéaire : 2x et zoom numérique : 1. NOTE: Les paramètres de balayage mentionnés ci-dessus doivent être optimisés pour chaque microscope confocal et objectif utilisé.</li>
	<li>Réglez le gain et le gain numérique de manière appropriée afin qu’aucun pixel saturé ne soit détecté sur l’indicateur de portée. REMARQUE: Corrigez le signal d’arrière-plan en ajustant le décalage.</li>
	<li>Une fois les LD correctement identifiés, acquérir l’image avec les canaux BODIPY et DAPI. REMARQUE: Toutes les images doivent être acquises dans les mêmes conditions (exposition et paramètres généraux) pour chaque canal de couleur.</li>
	<li>Pour créer des images grand angle (Figure 2), remplacez l’objectif par un objectif a10x (plan-neofluar : 10x/0,3).</li>
	<li>Sélectionnez le mode Mosaïque et créez des mosaïques de 5 images pour 5. REMARQUE: Dans ce travail, chaque tuile avait un chevauchement de 10% afin de fusionner correctement les tuiles pour l’analyse.</li>
	<li>Pour créer des vues 3D et orthogonales (Figure 3A), placez une goutte d’huile d’immersion sur le dessus du verre de couverture et changez l’objectif pour une lentille d’objectif 40x (plan-neofluar : huile 40x/1,30).</li>
	<li>Sélectionnez le mode Z-Stack et, en ajustant le plan Z, définissez la première et la dernière position pour l’acquisition avec une tranche optique à une épaisseur optimale (~0,5 μm) pour vous assurer que toutes les gouttelettes sont capturées. REMARQUE: Pour accélérer l’acquisition de l’image et éviter le blanchiment, la tranche optique peut être ajustée à une taille sous-optimale, assurant un suréchantillonnage d’au moins 30% pour une bonne reconstruction 3D.</li>
	<li>Sélectionnez le module Ortho et créez des vues orthogonales.</li>
	<li>Acquérir des images 3D en sélectionnant le module 3D en suivant le mode de rendu de transparence avec le logiciel de microscope confocal.</li>
</ol>7. Analyse des images
<ol><li>Traitez et analysez les images monoplan (grossissement 20x) avec CellProfiler (version 4.2.5). REMARQUE : Le pipeline utilisé dans ce travail a été adapté d’Adomshick et al.45.</li>
	<li>Cliquez sur le module Images dans le coin supérieur gauche de la fenêtre CellProfiler et téléchargez les images sous forme de fichiers .tiff.</li>
	<li>Utilisez le module NamesAndTypes pour trier les images colorées BODIPY- (gouttelettes) et DAPI- (noyaux) en fonction des noms de fichiers. Effectuez l’analyse LD uniquement avec des images colorées BODIPY.</li>
	<li>Pour démarrer la construction du pipeline, cliquez sur Ajuster les modules et sélectionnez le module ColorToGray pour convertir les images en images en niveaux de gris. Remarque : Pour identifier les objets, des images en niveaux de gris sont requises.</li>
	<li>Identifiez les gouttelettes à l’aide du module IdentifyPrimaryObjects à l’aide de l’image en niveaux de gris. REMARQUE: Les paramètres de ce module doivent être ajustés pour obtenir une bonne identification LD. Dans ce travail, la définition des LD avec une taille comprise entre 6 pixels et 300 pixels et un facteur de correction de seuil de 1,0 a conduit à l’identification la plus précise.</li>
	<li>Pour mesurer l’intensité en pixels des gouttelettes lipidiques identifiées, ajoutez un module MeasureObjectIntensité .</li>
	<li>Ajouter un module FilterObjects supplémentaire pour s’assurer que seuls les signaux les plus forts sont quantifiés tandis que les signaux moins intenses sont exclus de l’analyse finale des gouttelettes lipidiques (intensité minimale : 0,15 ; intensité maximale : 1 unité arbitraire).</li>
	<li>Pour mesurer les LD liées aux données de sortie, ajoutez le module MeasureObjectSizeShape .</li>
	<li>Ajoutez un module OverlayOutline à ce stade pour superposer la gouttelette identifiée sur l’image d’origine et, ainsi, assurez-vous que la segmentation semble précise sur l’image non traitée. REMARQUE : Il s’agit d’une étape facultative (contrôle qualité).</li>
	<li>Ajoutez un module ExportToSpreadsheet à la fin et cliquez sur le bouton Analyser les images dans le coin inférieur gauche.</li>
</ol>8. Analyse statistique
<ol><li>Exprimer les résultats sous forme de moyenne ± d’erreur-type de la moyenne (S.E.M.) à l’aide de n’importe quel logiciel d’analyse statistique. REMARQUE: Dans cette étude, le logiciel GraphPad a été utilisé pour l’analyse statistique.</li>
	<li>Analyser la distribution des valeurs à l’aide du test de Kolmogorov-Smirnov pour évaluer les écarts significatifs par rapport à la normalité. Analysez les données paramétriques à l’aide du test t non apparié du étudiant. REMARQUE : Les valeurs de p < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.</li>
</ol>

Évaluation de la stéatose hépatique avec reconstruction de gouttelettes lipidiques par fluorescence 3D

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole BODIPY 493/503 basé sur la fluorescence pour l’évaluation de la LD visait à développer une nouvelle approche d’imagerie pour l’évaluation de la stéatose hépatique. Compte tenu de la forte corrélation entre l’obésité et la stéatose hépatique, le régime alimentaire riche en graisses de style occidental a été utilisé pour établir un modèle animal de stéatosehépatique 26. Une forte augmentation de la teneur en TG hépatique a été confirmée par un kit de dosa...

Les gouttelettes lipidiques (LD), classiquement considérées comme des dépôts d’énergie, sont des organites cellulaires spécialisés qui interviennent dans le stockage des lipides, et elles comprennent un noyau lipidique neutre hydrophobe, qui contient principalement des esters de cholestérol et des triglycérides (TG), encapsulés par une monocouche phospholipide 1,2,3.
La biogenèse de la LD se produit dans le réticulum endoplasmique (RE), en commençant par la synthèse du triacylglycérol (TAG) et des esters stéroliques. Les lipides neutres sont diffusés entre les folioles de la bicouche ER à de faibles concentrations, mais fusionnent en lentilles d’huile qui se développent et bourgeonnent en gouttelettes presque sphériques de la membrane ER lorsque leur concentration intracellulaire augmente4. Par la suite, les protéines de la bicouche ER et du cytosol, en particulier la famille des protéines perilipin (PLIN), se transloquent à la surface des LD pour faciliter le bourgeonnement 5,6,7,8,9.
Grâce à la synthèse de nouveaux acides gras et à la fusion ou à la coalescence des LD, les LD atteignent différentes tailles. Par conséquent, la taille et le nombre de TA diffèrent considérablement d’un type de cellules à l’autre. De petites gouttelettes (300-800 nm de diamètre), connues sous le nom de LD initiales (iLD), peuvent être formées par presque toutes les cellules4. Plus tard dans la formation de LD, la plupart des cellules sont capables de convertir certaines iLD en LD plus grandes en expansion (eLDs >1 μm de diamètre). Pourtant, seuls des types cellulaires spécifiques, tels que les adipocytes et les hépatocytes, ont la capacité de former des LD géantes ou surdimensionnées (jusqu’à des dizaines de microns de diamètre)4,10.
Les LD jouent un rôle très important dans la régulation du métabolisme des lipides cellulaires, la suppression de la lipotoxicité et la prévention du stress des urgences, du dysfonctionnement mitochondrial et, finalement, de la mort cellulaire causée par les acides gras libres (AG)11,12,13,14. En outre, les LD ont également été impliqués dans la régulation de l’expression génique, la séquestration des protéines de réplication virale et le trafic et la signalisationmembranaires 15,16,17. Par conséquent, la mauvaise régulation de la biogenèse de la ML est une caractéristique des maladies chroniques associées au syndrome métabolique, à l’obésité, au diabète sucré de type 2 (DT2) et / ou à l’artériosclérose, pour n’en nommer quequelques-unes 18,19,20.
Le foie, en tant que plaque tournante métabolique, est principalement responsable du métabolisme des lipides en stockant et en traitant les lipides et, par conséquent, il est constamment menacé par la lipotoxicité21. La stéatose hépatique (SH) est une caractéristique commune d’une série de maladies hépatiques progressives et se caractérise par une accumulation excessive de lipides intracellulaires sous forme de LD cytosoliques qui, en fin de compte, peuvent entraîner un dysfonctionnement métabolique hépatique, une inflammation et des formes avancées de stéatose hépatique non alcoolique22,23,24,25. L’HS se produit lorsque le taux d’oxydation et d’exportation des acides gras sous forme de triglycérides dans les lipoprotéines de très basse densité (VLDL) est inférieur au taux d’absorption hépatique des acides gras par le plasma et la synthèse de novo des acides gras26. L’accumulation hépatique de lipides se produit souvent sous deux formes - stéatose microvésiculeuse et macrovésiculeuse - et celles-ci présentent des caractéristiques cytoarchitectoniques distinctes27. Typiquement, la stéatose microvésiculeuse est caractérisée par la présence de petites LD dispersées dans tout l’hépatocytes avec le noyau placé au centre, tandis que la stéatose macrovésiculeuse est caractérisée par la présence d’une seule grande LD qui occupe la plus grande partie de l’hépatocytes, poussant le noyau vers la périphérie28,29. Notamment, ces deux types de stéatose sont souvent trouvés ensemble, et on ne sait toujours pas comment ces deux modèles de LD influencent la pathogenèse de la maladie, car les preuves sont encore incohérentes 31,32,33,34. Pourtant, ce type d’analyse est souvent utilisé comme « norme de référence » dans les études précliniques et cliniques pour comprendre le comportement dynamique des TA et caractériser la stéatose hépatique 29,34,35,36.
Les biopsies hépatiques, l’étalon-or pour le diagnostic et le classement de l’HS, sont systématiquement évaluées par analyse histologique de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E), où les gouttelettes lipidiques sont évaluées comme des vacuoles non colorées dans les sections hépatiques colorées H & E37. Bien qu’acceptable pour l’évaluation de la stéatose macrovésiculaire, ce type de coloration restreint généralement l’évaluation de la stéatose microvésiculeuse38. Les colorants diazoélectriques liposolubles, tels que l’Oil Red O (ORO), sont classiquement combinés à la microscopie à fond clair pour analyser les réserves lipidiques intracellulaires, mais ceux-ci présentent encore un certain nombre d’inconvénients: (i) l’utilisation d’éthanol ou d’isopropanol dans le processus de coloration, ce qui provoque souvent la perturbation des LD natives et une fusion occasionnelle malgré la fixation des cellules39; ii) la nature longue, car la solution ORO nécessite la dissolution et la filtration de la poudre fraîche en raison de la durée de conservation limitée, ce qui contribue à des résultats moins cohérents; (iii) et le fait que l’ORO colore plus que de simples gouttelettes lipidiques et surestime souvent la stéatose hépatique38.
Par conséquent, des fluorophores lipophiles perméables aux cellules, tels que le rouge du Nil, ont été utilisés dans des échantillons vivants ou fixes pour surmonter certaines des limitations susmentionnées. Cependant, la nature non spécifique du marquage des organites lipidiques cellulaires rétrécit à plusieurs reprises les évaluations de la LD40. De plus, les propriétés spectrales du Rouge du Nil varient en fonction de la polarité de l’environnement, ce qui peut souvent conduire à des décalagesspectraux41.
La sonde fluorescente lipophile 1,3,5,7,8-pentaméthyl-4-bora-3a,4adiaza-s-indacene (longueur d’onde d’excitation : 480 nm ; émission maximale : 515 nm ; BODIPY 493/503) présente des caractéristiques d’hydrophobicité qui permettent son absorption rapide par les LD intracellulaires, s’accumule dans le noyau des gouttelettes lipidiques et, par la suite, émet une fluorescence vert vif12. Contrairement au Nile Red, BODIPY 493/503 est insensible à la polarité de l’environnement et s’est avéré plus sélectif, car il affiche une luminosité élevée pour l’imagerie LD. Afin de colorer les LD neutres, ce colorant peut être utilisé dans des cellules vivantes ou fixes et couplé avec succès à d’autres méthodes de coloration et/ou d’étiquetage42. Un autre avantage du colorant est qu’il nécessite peu d’effort pour être placé dans une solution et qu’il est stable, éliminant ainsi le besoin de le préparer fraîchement pour chaque expérience42. Même si la sonde BODIPY 493/503 a été utilisée avec succès pour visualiser la localisation et la dynamique des TA dans les cultures cellulaires, certains rapports ont également démontré l’utilisation fiable de ce colorant comme outil d’imagerie des LD dans les tissus, y compris le muscle vastus lateralis humain43, le muscle soléaire du rat 42 et l’intestin de souris44.
Ici, nous proposons un protocole optimisé basé sur BODIPY 493/503 comme approche analytique alternative pour l’évaluation du nombre de DL, de la surface et du diamètre dans des échantillons de foie à partir d’un modèle animal de stéatose hépatique. Cette procédure couvre la préparation des échantillons de foie, la section des tissus, les conditions de coloration, l’acquisition d’images et l’analyse des données.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td>
			<td>D3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10191455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator CC</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td>Used to design the figures</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic analyzer Hitachi 717</td>
			<td>Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany</td>
			<td>8177-30-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier pen (Liquid blocker super pap pen)</td>
			<td>Daido Sangyo Co., Ltd, Japon</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade</td>
			<td>Leica</td>
			<td>221052145</td>
			<td>Used in the cryostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Profiler version 4.2.5</td>
			<td>https://cellprofiler.org/releases/</td>
			<td>Used to analyse the acquired images</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Menzel-Glaser, Germany</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td>
			<td>D-8418</td>
			<td>Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic 
			and flammable. Vapors may cause 
			irritation. Manipulate in a fume 
			hood. Avoid direct contact with skin. 
			Wear rubber gloves, protective eye 
			goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice container (styrofoam cooler)</td>
			<td>Novolab</td>
			<td>A26742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish (H 25 mm, &#248; 
			150 mm)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td>Used to weigh the liver after dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycergel</td>
			<td>DAKO Omnis</td>
			<td>S303023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software, version 9.3.1</td>
			<td>GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fat diet</td>
			<td>Envigo, Barcelona, Spain</td>
			<td>MD.08811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Nimatek&#160; 100 mg/mL)</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>791/01/14DFVPT</td>
			<td>Used at a final concentration of 75 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope&#160; (QUASAR detection unit; )</td>
			<td>Carl Zeiss, germany</td>
			<td>LSM 710 Axio Observer Z1 microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>1838 ESP / 020/01/07RFVPT</td>
			<td>Used at a final concentration of 1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>BD microlance</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No 15 Sterile carbon steel scalpel 
			Blade</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)</td>
			<td>&#160;Carl Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brushes</td>
			<td>Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X</td>
			<td>&#160;Used to handle cryosections</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (Minipuls 3)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>1004170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle, 125 mm (5&#34;), No. 3</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide staining system StainTray</td>
			<td>Simport Scientific</td>
			<td>M920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard diet</td>
			<td>&#160;Mucedola</td>
			<td>4RF21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>Menzel-Glaser, Germany</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT mounting media</td>
			<td>VWR CHEMICALS</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglycerides colorimetric assay kit</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10010303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Bandelin Sonorex</td>
			<td>&#160;TK 52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
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analysis of fluorescent-stained lipid droplets with 3d reconstruction for hepatic steatosis assessment

Les gouttelettes lipidiques (LD) sont des organites spécialisés qui interviennent dans le stockage des lipides et jouent un rôle très important dans la suppression de la lipotoxicité et la prévention du dysfonctionnement causé par les acides gras libres (AG). Le foie, compte tenu de son rôle essentiel dans le métabolisme des graisses du corps, est constamment menacé par l’accumulation intracellulaire de LD sous forme de stéatose hépatique microvésiculaire et macrovésiculaire. La caractérisation histologique des LD est généralement basée sur des colorants diazoélectriques liposolubles, tels que la coloration Oil Red O (ORO), mais un certain nombre d’inconvénients entravent systématiquement l’utilisation de cette analyse avec des échantillons de foie. Plus récemment, les fluorophores lipophiles 493/503 sont devenus populaires pour visualiser et localiser les LD en raison de leur absorption et de leur accumulation rapides dans le noyau de gouttelettes lipidiques neutres. Même si la plupart des applications sont bien décrites dans les cultures cellulaires, il y a moins de preuves démontrant l’utilisation fiable des sondes fluorophores lipophiles comme outil d’imagerie LD dans les échantillons de tissus. Nous proposons ici un protocole optimisé basé sur le dipyrrométène de bore (BODIPY) 493/503 pour l’évaluation des LD dans des échantillons de foie à partir d’un modèle animal de stéatose hépatique induite par un régime riche en graisses (HFD). Ce protocole couvre la préparation des échantillons de foie, la section des tissus, la coloration BODIPY 493/503, l’acquisition d’images et l’analyse des données. Nous démontrons une augmentation du nombre, de l’intensité, du rapport de surface et du diamètre des LD hépatiques lors de l’alimentation HFD. En utilisant des projections orthogonales et des reconstructions 3D, il a été possible d’observer la teneur complète en lipides neutres dans le noyau LD, qui apparaissait comme des gouttelettes presque sphériques. De plus, avec le fluorophore BODIPY 493/503, nous avons pu distinguer des microvésicules (1 μm < j ≤ 3 μm), des vésicules intermédiaires (3 μm < d ≤ 9 μm) et des macrovésicules (d > 9 μm), permettant la discrimination réussie de la stéatose microvésiculaire et macrovésiculaire. Dans l’ensemble, ce protocole basé sur la fluorescence BODIPY 493/503 est un outil fiable et simple pour la caractérisation hépatique de la LD et peut représenter une approche complémentaire aux protocoles histologiques classiques.

Lipid droplets (LDs), classically viewed as energy depots, are specialized cellular organelles that mediate lipid storage, and they comprise a hydrophobic neutral lipid core, which mainly contains cholesterol esters and triglycerides (TGs), encapsulated by a phospholipid monolayer1,2,3.
LD biogenesis occurs in the endoplasmic reticulum (ER), starting with the synthesis of triacylglycerol (TAG) and sterol esters. Neutral lipids are diffused between the leaflets of the ER bilayer at low concentrations but coalesce into oil lenses that grow and bud into nearly spherical droplets from ER membrane when their intracellular concentration increases4. Subsequently, proteins from the ER bilayer and cytosol, particularly the perilipin (PLIN) protein family, translocate to the surfaces of the LDs to facilitate budding5,6,7,8,9.
Through new fatty acid synthesis and LD fusion or coalescence, LDs grow into different sizes. Accordingly, the size and number of LDs differ considerably across different cell types. Small droplets (300-800 nm diameter), which are known as initial LDs (iLDs), can be formed by nearly all cells4. Later in LD formation, most cells are able to convert some iLDs into larger ones-expanding LDs (eLDs &#62;1 &#181;m in diameter). Yet, just specific cell types, such as adipocytes and hepatocytes, have the capacity to form giant or supersized LDs (up to tens of microns in diameter)4,10.
LDs play a very important role in the regulation of cellular lipid metabolism, suppressing lipotoxicity, and preventing ER stress, mitochondrial dysfunction, and, ultimately, cell death caused by free fatty acids (FAs)11,12,13,14. Furthermore, LDs have also been implicated in the regulation of gene expression, viral replication protein sequestration, and membrane trafficking and signaling15,16,17. Therefore, the misregulation of LD biogenesis is a hallmark of chronic diseases associated with metabolic syndrome, obesity, type 2 diabetes mellitus (T2DM), and/or arteriosclerosis, to name just a few18,19,20.
The liver, as a metabolic hub, is mostly responsible for lipid metabolism by storing and processing lipids, and, therefore, it is constantly threatened by lipotoxicity21. Hepatic steatosis (HS) is a common feature of a series of progressive liver diseases and is characterized by excessive intracellular lipid accumulation in the form of cytosolic LDs that, ultimately, may lead to liver metabolic dysfunction, inflammation, and advanced forms of nonalcoholic fatty liver disease22,23,24,25. HS occurs when the rate of fatty acid oxidation and export as triglycerides within very low-density lipoproteins (VLDLs) is lower than the rate of hepatic fatty acid uptake from the plasma and de novo fatty acid synthesis26. The hepatic accumulation of lipids often occurs in two forms-microvesicular and macrovesicular steatosis-and these display distinct cytoarchitectonic characteristics27. Typically, microvesicular steatosis is characterized by the presence of small LDs dispersed throughout the hepatocyte with the nucleus placed centrally, whereas macrovesicular steatosis is characterized by the presence of a single large LD that occupies the greater part of the hepatocyte, pushing the nucleus to the periphery28,29. Notably, these two types of steatosis are often found together, and it remains unclear how these two LD patterns influence disease pathogenesis, as evidence is still inconsistent31,32,33,34. Yet, such type of analysis is often employed as a &#34;reference standard&#34; in preclinical and clinical studies to understand the dynamic behavior of LDs and characterize hepatic steatosis29,34,35,36.
Liver biopsies, the gold standard for diagnosing and grading HS, are routinely assessed by histological hematoxylin and eosin (H&#38;E) analysis, where lipid droplets are evaluated as unstained vacuoles in H&#38;E-stained liver sections37. While acceptable for macrovesicular steatosis evaluation, this type of staining generally narrows the assessment of microvesicular steatosis38. Lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO), are classically combined with brightfield microscopy to analyze intracellular lipid stores, but these still have a number of disadvantages: (i) the usage of ethanol or isopropanol in the staining process, which often causes the disruption of the native LDs and occasional fusion despite the cells being fixed39; (ii) the time-consuming nature, as ORO solution requires fresh powder dissolving and filtering due to the limited shelf life, thus contributing to less consistent results; (iii) and the fact that ORO stains more than just lipid droplets and often overestimates hepatic steatosis38.
Consequently, cell-permeable lipophilic fluorophores, such as Nile Red, have been used in either live or fixed samples to overcome some of the aforementioned limitations. However, the non-specific nature of cellular lipid organelle labeling repeatedly narrows LD assessments40. Moreover, the spectral properties of Nile Red vary according to the polarity of the environment, which can often lead to spectral shifts41.
The lipophilic fluorescent probe 1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4adiaza-s-indacene (excitation wavelength: 480 nm; emission maximum: 515 nm; BODIPY 493/503) exhibits hydrophobicity characteristics that allow its rapid uptake by intracellular LDs, accumulates in the lipid droplet core, and, subsequently, emits bright green fluorescence12. Unlike Nile Red, BODIPY 493/503 is insensitive to the environment polarity and has been shown to be more selective, as it displays high brightness for LD imaging. In order to stain neutral LDs, this dye can be used in live or fixed cells and successfully coupled with other staining and/or labeling methods42. Another advantage of the dye is that it requires little effort to place into a solution and is stable, thus eliminating the need to freshly prepare it for each experiment42. Even though the BODIPY 493/503 probe has been successfully employed to visualize the localization and dynamics of LDs in cell cultures, some reports have also demonstrated the reliable use of this dye as an LD imaging tool in tissues including the human vastus lateralis muscle43, the rat soleus muscle42, and the mouse intestine44.
Herein, we propose an optimized BODIPY 493/503-based protocol as an alternative analytical approach for the evaluation of the LD number, area, and diameter in liver specimens from an animal model of hepatic steatosis. This procedure covers liver sample preparation, tissue sectioning, staining conditions, image acquisition, and data analysis.

Pleins feux sur l’auteur : Analyse de gouttelettes lipidiques colorées par fluorescence avec reconstruction 3D pour l’évaluation de la stéatose hépatique  

Analyse de gouttelettes lipidiques colorées par fluorescence avec reconstruction 3D pour l’évaluation de la stéatose hépatique

This imaging approach allows the three-dimensional reconstruction of hepatic lipid droplet deposition and overcomes the main disadvantages of classic histological staining that narrowed the successful discrimination between micro and macrovesicular steatosis. The assessment of microvesicular steatosis is when gold-standard histological stainings are used, both and Oil Red, due to disruption and occasional fusion of native lipid droplets. The pro-BODIPY offers an alternative to the routine protocols for microvesicular hepatic steatosis assessment due to its right hydrophobicity for a fast uptake and effective tagging of lipid droplets, being not only insensitive to the environment polarity, but also extremely selective.This imaging approach encloses broader applications in combination with immunochemistry techniques, allowing the simultaneous detection of other subcellular antigens that may advance the study of lipid droplets'biogenesis and dynamics, underpinning micro and macrovesicular hepatic steatosis.

L’exécution réussie de cette technique devrait entraîner une coloration claire des gouttelettes lipidiques pour la caractérisation simultanée de la morphologie LD (forme et densité du noyau lipidique basée sur la reconstruction 3D) ainsi que de leur distribution spatiale, de leur nombre par surface totale et de leur taille moyenne (évaluée avec le pipeline décrit ci-dessus, Figure 1).
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Ici, nous démontrons un protocole optimisé basé sur la fluorescence BODIPY 493/503 pour la caractérisation des gouttelettes lipidiques dans le tissu hépatique. Grâce à l’utilisation de projections orthogonales et de reconstructions 3D, le fluorophore permet une discrimination réussie entre la stéatose microvésiculeuse et macrovésiculeuse et peut représenter une approche complémentaire aux protocoles histologiques classiques pour l’évaluation de la stéatose hépatique.

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing ...

Cette approche d’imagerie permet la reconstruction tridimensionnelle du dépôt de gouttelettes lipidiques hépatiques et surmonte les principaux inconvénients de la coloration histologique classique qui a réduit la discrimination réussie entre la stéatose micro et macrovésiculaire. L’évaluation de la stéatose microvésiculeuse est lorsque des colorations histologiques de référence sont utilisées, à la fois et Oil Red, en raison de la perturbation et de la fusion occasionnelle de gouttelettes lipidiques natives. Le pro-BODIPY offre une alternative aux protocoles de routine pour l’évaluation de la stéatose hépatique microvésiculaire en raison de son hydrophobicité droite pour une absorption rapide et un marquage efficace des gouttelettes lipidiques, étant non seulement insensible à la polarité de l’environnement, mais aussi extrêmement sélectif.Cette approche d’imagerie renferme des applications plus larges en combinaison avec des techniques d’immunochimie, permettant la détection simultanée d’autres antigènes subcellulaires qui peuvent faire progresser l’étude de la biogenèse et de la dynamique des gouttelettes lipidiques, sous-tendant la stéatose hépatique micro et macrovésiculaire.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment

3.0K vues.  University of Coimbra. Cette approche d’imagerie permet la reconstruction tridimensionnelle du dépôt de gouttelettes lipidiques hépatiques et surmonte les principaux inconvénients de la coloration histologique classique qui a réduit la discrimination réussie entre la stéatose micro et macrovésiculaire. L’évaluation de la stéatose microvésiculeuse est lorsque des colorations histologiques de référence sont utilisées, à la fois et Oil Red, en raison de la perturbation et de la fusion occasionnelle ...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Analyse de gouttelettes lipidiques colorées par fluorescence avec reconstruction 3D pour l’évaluation de la stéatose hépatique  

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing dysfunction caused by free fatty acids (FAs). The liver, given its critical role in the body's fat metabolism, is persistently threatened by the intracellular accumulation of LDs in the form of both microvesicular and macrovesicular hepatic steatosis. The histologic characterization of LDs is typically based on lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO) staining, but a number of disadvantages consistently hamper the use of this analysis with liver specimens. More recently, lipophilic fluorophores 493/503 have become popular for visualizing and locating LDs due to their rapid uptake and accumulation into the neutral lipid droplet core. Even though most applications are well-described in cell cultures, there is less evidence demonstrating the reliable use of lipophilic fluorophore probes as an LD imaging tool in tissue samples. Herein, we propose an optimized boron dipyrromethene (BODIPY) 493/503-based protocol for the evaluation of LDs in liver specimens from an animal model of high-fat diet (HFD)-induced hepatic steatosis. This protocol covers liver sample preparation, tissue sectioning, BODIPY 493/503 staining, image acquisition, and data analysis. We demonstrate an increased number, intensity, area ratio, and diameter of hepatic LDs upon HFD feeding. Using orthogonal projections and 3D reconstructions, it was possible to observe the full content of neutral lipids in the LD core, which appeared as nearly spherical droplets. Moreover, with the fluorophore BODIPY 493/503, we were able to distinguish microvesicles (1 &#181;m &lt; d &#8804; 3 &#181;m), intermediate vesicles (3 &#181;m &lt; d &#8804; 9 &#181;m), and macrovesicles (d &gt; 9 &#181;m), allowing the successful discrimination of microvesicular and macrovesicular steatosis. Overall, this BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol is a reliable and simple tool for hepatic LD characterization and may represent a complementary approach to the classical histological protocols.

Herein, we demonstrate an optimized BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol for lipid droplet characterization in liver tissue. Through the use of orthogonal projections and 3D reconstructions, the fluorophore allows for successful discrimination between microvesicular and macrovesicular steatosis and may represent a complementary approach to the classical histological protocols for hepatic steatosis assessment.

Recherche

Biochimie

Frozen Liver Tissue Sectioning and BODIPY Staining of Lipid Droplets

Turn on the cryostat and cut 12-micron-thick sections of the frozen liver tissue collected from a rat. Place the sections onto the labeled microscope slides at room temperature. For BODIPY staining, wash the tissue sections thrice with PBS for five minutes each.After the last wash, circle the sections on the slide with a hydrophobic layer using a barrier pen. Prepare a staining solution containing BODIPY 493/503 and DAPI. Then, pipette 75 microliters of the solution onto each slide.Incubate the slides at room temperature for 40 minutes in the dark. Following incubation, wash the slides thrice with PBS for five minutes each. Then, using a fluorescence mounting medium, carefully mount cover slips on each slide.Allow the slides to dry for 30 minutes before sealing the edges with nail polish.

Sectionnement des tissus hépatiques congelés et coloration BODIPY des gouttelettes lipidiques

Image Acquisition of Lipid Droplets and Analysis

Turn on the laser scanning confocal microscope and place the slide on the slide holder. For image visualization and acquisition, select the 20X objective lens. From the confocal software, select sequential scan mode to avoid crosstalk between the BODIPY 493/503 and DAPI.Then excite the BODIPY 493/503 die using the 488 nanometer argon laser line and the DAPI stain using the 405 nanometer laser line. Set the emission ranges at 493 to 589 nanometers for BODIPY and 410 to 464 nanometers for DAPI. Next, configure the microscope settings by adjusting frame sizes, scan speed, and averaging which includes number two times bit depth as 12 bits, direction as bidirectional, scan area digital zoom minus one, and pinhole minus one area unit.Adjust the gain and digital gain settings. Ensure there are no saturated pixels as indicated by the range indicator. After accurately identifying the lipid droplets, acquire the image with the BODIPY and DAPI channels.To create wide area images, switch to a 10X subjective lens. Then activate tile scan mode and configure it to generate five by five mosaic images. To generate 3D and orthogonal views, apply a drop of immersion oil on the top of the cover glass and change the objective lens to a 40X lens.Select the Z-stack mode. Adjust the Z-plane to define the first and last positions for image capture, ensuring an optical slice thickness of approximately 0.5 microns to capture all droplets in focus. Select the ortho module and create orthogonal views.Acquire 3D images by selecting the 3D module following transparency rendering mode. After image acquisition, begin processing and analyzing single plane images using CellProfiler. Upload the images in TIF format by clicking on the images mode in the top left corner of the CellProfiler interface.Use the names and types module to sort between BODIPY droplet and DAPI nuclei stained images based on the filenames. For lipid droplet analysis, use only BODIPY stained images. Initiate pipeline construction by clicking on adjust modules and select the color to gray module to convert the images into gray scale.Then using identify primary objects module, define lipid droplets between 6 to 300 pixels and a threshold correction factor of one to detect lipid droplets within the gray scale images. To measure the pixel intensity of the identified lipid droplets, add a measure object intensity module. Incorporate an additional filter objects module to ensure that only the strongest signals are quantified while less intense signals are excluded from the final lipid droplet analysis.Next, to measure the lipid droplets related to the output data, add the measure object size shape module. Then add an overlay outlines module to overlay the identified droplet on the original image and thus ensure that the segmentation looks accurate on the unprocessed image as well. Once done, add an export to spreadsheet module and click on the analyze images button from the bottom left corner.Compared to the control, HFD-fed animals presented a pronounced dyslipidemic profile and subtle increase in circulating triglycerides levels. Wide area images revealed increased lipid droplets across the livers of HFD-fed animals. Analysis with CellProfiler revealed an increased number of hepatic lipid droplets, augmented BODIPY fluorescence intensity, 360%area ratio, and larger diameters.Size distribution in HFD-fed animals revealed an increase in macro vesicular hepatic lipid droplets of more than nine microns and a reduction in microvesicles of less than three microns.