Ce protocole fournit une méthode simple de perfusion fixative chez la souris qui permettra l’étude histologique des tissus du SNC sans investissement significatif. Le principal avantage de la méthode de perfusion par gravité présentée ici est que l’appareil de profusion peut être construit avec des composants facilement disponibles. Arnav Rana, un étudiant MD-PhD du laboratoire du Dr Xin Jie Chen, fera la démonstration de la procédure.
Pour commencer, à l’aide d’une lame de rasoir tranchante, coupez les pailles intérieures de deux bouteilles de lavage de 500 millilitres en les coupant au ras du côté intérieur de la vis du bouchon. Coupez un trou carré de quatre centimètres sur quatre dans le fond de chaque bouteille tampon, puis coupez un autre petit trou dans le fond de chaque bouteille pour permettre le passage d’une micro spatule en acier inoxydable pliée. Ensuite, créez une courbure en forme de S dans les spatules micros afin qu’elles puissent être utilisées comme crochets pour suspendre les bouteilles tampons.
Insérez les micro spatules pliées dans les ouvertures appropriées dans les bouteilles tampons. Ensuite, connectez étroitement deux tubes de 25 centimètres de long avec les sorties de paille de bouteille extérieures et joignez les extrémités de ces tubes avec le connecteur Y, puis joignez le tube de 2 mètres de long à l’extrémité libre du connecteur Y. Après avoir retiré le piston d’une seringue de 1 millilitre, coupez la seringue à environ 6 centimètres de la pointe en marquant d’abord le plastique avec une lame de rasoir, puis en claquant brusquement le plastique de la seringue.
Insérez la face coupée de la seringue dans l’extrémité libre du tube en plastique à une profondeur suffisante et assurez-vous d’une étanchéité étanche. Ensuite, étiquetez une bouteille tampon comme PFA et l’autre comme PBS. Mesurez environ 1/3 de la longueur loin de l’ouverture de la bouteille et tracez une ligne autour de la circonférence de la bouteille à cet endroit pour indiquer le niveau de remplissage approprié des solutions de perfusat.
Après avoir redressé un grand trombone, créez une boucle qui peut s’adapter autour de la circonférence du tube et placez cette boucle autour du tube, juste à proximité de la seringue, puis placez un bloc de polystyrène de taille appropriée dans le bac en verre, placez les extrémités du trombone dans le bloc de polystyrène pour fixer le tube et à l’aide d’une serviette en papier, soulevez l’extrémité avant du plateau de verre d’environ 2 centimètres. Après avoir rincé un bécher de 1 litre avec de l’eau distillée, remplissez-le d’environ 800 millilitres d’eau de qualité biologie moléculaire de 18 milliohms. Chauffer le bécher au micro-ondes pendant trois minutes ou jusqu’à ce que la température de l’eau atteigne 65 degrés Celsius, puis placez-le sur une plaque chauffante ou une plaque à remuer conservée dans une hotte.
Ensuite, rincez une tige d’agitation avec de l’eau distillée et placez-la dans le bécher. Démarrez l’agitateur et tournez la plaque chauffante à feu moyen, en veillant à ce que la température de l’eau ne dépasse pas 70 degrés Celsius. Après avoir porté un masque chirurgical, des gants et une blouse de laboratoire, mesurez 40 grammes de poudre de PFA et ajoutez-la dans l’eau chauffée, puis à l’aide d’une pipette de transfert, ajoutez quelques gouttes d’hydroxyde de sodium à 5 molaires à la solution.
Laissez la poudre se dissoudre complètement. Si la poudre n’est pas complètement dissoute, ajoutez plus d’hydroxyde de sodium au besoin. Une fois que tout le PFA est presque dissous, arrêtez l’agitation et le chauffage et ajoutez immédiatement 100 millilitres de PBS 10x, puis utilisez l’eau de qualité biologie moléculaire de 18 milliohms pour recharger le bécher à la marque de 1 litre.
Couvrir le bécher avec une pellicule de plastique et le placer dans un congélateur de moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce que la solution atteigne la température ambiante. Après avoir étalonné un pH-mètre à l’aide d’étalons appropriés, mesurez le pH de la solution pendant que le bécher est sur une plaque d’agitation. Ajouter l’acide chlorhydrique jusqu’à ce que le pH atteigne 7,4.
Si le pH est trop bas, ajoutez de l’hydroxyde de sodium à 5 molaires pour augmenter le pH. Ensuite, connectez une fiole sous vide à l’aspirateur et placez un entonnoir Buchner en céramique propre avec du papier filtre dans la fiole. Après avoir allumé le vide, mouillez le papier filtre à l’aide d’une pipette de transfert remplie de la solution de PFA à 4%, puis versez lentement la solution sur le papier filtre jusqu’à ce que toute la solution ait été filtrée.
Après le filtrage, conservez la solution dans un récipient protégé contre la lumière à 4 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Dans la hotte, placez un bloc de dissection en polystyrène dans un plateau en verre. Assurez-vous que le bloc de dissection comporte cinq à six aiguilles courtes pour retenir la souris pendant la chirurgie et deux aiguilles longues pour soutenir le tube de perfusion.
Ensuite, rincez l’appareil de perfusion à l’eau distillée. Une fois que toute l’eau s’est écoulée, suspendez les bouteilles de profusion un mètre au-dessus de l’animal à perfuser, puis préparez 1x PBS non stérile en utilisant 10x PBS dilué avec de l’eau de qualité biologie moléculaire. Serrez la ligne principale de l’appareil de perfusion à l’aide d’un hémostat, puis serrez la ligne PFA avec un autre hémostat.
Après avoir rempli le récipient tampon avec du PBS, placez l’extrémité de la seringue de l’appareil de perfusion dans un bécher pour collecter les déchets tampons et retirez l’hémostat obstruant la ligne principale. Pendant que le PBS circule à travers la ligne, tapotez vigoureusement sur les parois du tube pour éliminer l’air emprisonné. Une fois que tout l’air a été retiré du tampon et des lignes principales, obstruez le flux en plaçant un hémostat sur la ligne principale.
Ensuite, retirez l’hémostat de la ligne PFA, ce qui permet au PBS de s’écouler de manière rétrograde jusqu’à la bouteille PFA tout en tapotant les bulles de la ligne PFA. Continuez à laisser le PBS entrer dans la ligne PFA jusqu’à ce qu’il puisse être vu juste au-dessus de l’ouverture de la bouteille, puis obstruez la ligne PFA avec un hémostat pour arrêter le flux de PBS dans la bouteille PFA. Ensuite, connectez l’aiguille de perfusion papillon à la seringue de perfusion et ouvrez l’hémostat de la ligne principale pour rincer le PBS à travers la ligne et retirer les bulles de la seringue de perfusion.
Une fois les bulles enlevées, fermez l’hémostat de la ligne principale. Assurez-vous que la bouteille pbs est maintenant remplie d’environ 1/3 de PBS. Si nécessaire, rincez le PBS à travers la ligne principale ou remplissez plus de PBS dans la bouteille tampon jusqu’à 1/3 de sa pleine capacité.
Une fois que toutes les bulles ont été retirées du PBS, du PFA et des lignes principales, remplissez le flacon de PFA avec une solution de PFA à 4% à température ambiante jusqu’à la marque noire sur la bouteille. Ensuite, préparez-vous à une chirurgie de non-survie en nettoyant les instruments nécessaires d’abord avec de l’eau, puis avec de l’éthanol à 70%. Après avoir fixé une souris C57 noire 6J anesthésiée au bloc de polystyrène, commencez la chirurgie en soulevant la peau abdominale avec une pince cutanée et en coupant à travers la paroi abdominale avec de gros ciseaux.
Continuez la coupe abdominale de manière supérieure vers le foie, puis détachez le foie de la paroi abdominale antérieure et continuez l’incision initiale de manière supérieure vers le diaphragme. Lorsque l’incision atteint le diaphragme, à l’aide de ciseaux à dissection fine, faites un trou dans le diaphragme et coupez à travers les côtes du côté droit de la souris à environ la moitié de l’aisselle droite, puis faites une incision similaire, mais plus longue à travers le côté gauche du diaphragme presque jusqu’à l’aisselle gauche. Réfléchissez la paroi thoracique et épinglez-la au bloc de polystyrène.
Après avoir identifié le ventricule gauche, à l’aide d’une pince incurvée fine, maintenez le cœur stable avec une légère pression, puis ouvrez l’hémostat de la ligne principale pour permettre au PBS de circuler à travers l’aiguille et de percer immédiatement le ventricule gauche avec l’aiguille. Assurez-vous que l’aiguille n’est pas insérée plus de 0,5 centimètre dans le ventricule. Ensuite, posez le tube papillon sur un X fabriqué dans la mousse de polystyrène avec deux grandes aiguilles de calibre 18.
Identifiez la veine cave inférieure lorsqu’elle sort du foie et transectez-la à l’aide de ciseaux à dissection fine. Continuez la perfusion de PBS jusqu’à ce que le liquide qui s’écoule de la veine cave inférieure soit sans sang, puis travaillez rapidement, obstruez la ligne PBS avec un hémostat et ouvrez la ligne PFA. Laissez le PFA perfuser pendant quelques minutes jusqu’à ce que la queue commence à s’enrouler.
Une fois que la queue commence à s’enrouler, commencez une minuterie de 50 minutes. Après 50 minutes, obstruer la ligne principale avec un hémostat et retirer l’aiguille du ventricule gauche. Ensuite, placez la souris dans un récipient étiqueté de solution de PFA à 4 degrés Celsius pendant la nuit.
Une perfusion de haute qualité est indiquée par l’absence de sang dans le foie, la moelle épinière et les structures profondes du système nerveux central. Le sang observé dans le cerveau est situé entre le crâne et la dure-mère et n’est donc pas problématique ou ne suggère pas une perfusion de mauvaise qualité. La détection de l’alpha-synucléine à la suite de cette méthode de perfusion montre que l’alpha-synucléine phosphorylée s’accumule significativement plus chez les souris symptomatiques de 15,5 mois que chez les souris asymptomatiques de sept mois exprimant l’alpha-synucléine A53T humaine.
Ce résultat est cohérent avec les rapports décrivant un enrichissement de la cytopathologie dans les cornes antérieures de la moelle épinière et le mésencéphale de ces souris. Il est important qu’aucun organe abdominal ne soit coupé lors de l’accès à la cavité thoracique. De plus, l’aiguille de perfusion ne doit pas être placée trop profondément dans le ventricule gauche.
