Le but de cette vidéo est de décrire un modèle de culture d’organe cornéen humain du Stripping Only de Descemet avec une guérison accélérée, stimulée par le facteur de croissance des fibroblastes un. La dystrophie cornéenne endothéliale de Fuch, ou FECD, est une maladie caractérisée par une perte de la fonction de pompe dans les cellules endothéliales cornéennes et l’accumulation excessive de collagène et d’autres protéines de la matrice extracellulaire à la surface de la membrane de Descemet, formant des guttées cornéennes. Le seul traitement connu pour la FECD est la kératoplastie endothéliale sous différentes formes, qui comportent toutes un risque de rejet et de perte de cellules endothéliales.
Alors que les progrès de la chirurgie ophtalmique ont permis à ces procédures de devenir moins invasives au fil du temps, toute forme de transplantation comporte un risque de rejet et la possibilité d’une utilisation de stéroïdes à vie. Le Stripping Only de Descemet, ou DSO, est une alternative expérimentale dans laquelle les patients FECD atteints de guttae localisés au centre de la cornée ont le cercle central de quatre millimètres de la membrane de Descemet enlevé sans remplacement du greffon. L’élimination des guttées encourage les cellules périphériques saines à migrer vers l’intérieur et à reformer la monocouche endothéliale, inversant éventuellement l’œdème stromal et améliorant la vision.
Bien qu’il y ait de nombreux avantages à cette méthode, le processus de guérison est long et incohérent, et certains patients ont besoin d’une transplantation de secours si aucune guérison n’est observée dans le mois suivant la chirurgie. Un traitement qui stimule la cicatrisation plus rapide des plaies après DSO, peut faire de la procédure une option plus réalisable pour les patients atteints de FECD. Ce protocole modélise la procédure clinique de DSO dans un format de culture d’organes utilisant des cornées de donneurs humains, dans le but de tester des traitements pour améliorer la cicatrisation des plaies après DSO, afin de faire du DSO une option plus réalisable pour les patients atteints de FECD.
Notre laboratoire utilise ce modèle pour tester la cicatrisation des plaies dans les cornées traitées avec un facteur de croissance des fibroblastes artificiel pour lequel nous montrerons des résultats représentatifs plus tard dans cette vidéo. Dans cette partie de la procédure, un poinçon de biopsie sera utilisé pour marquer la zone de plaie de quatre millimètres à partir de laquelle la membrane de Descemet sera dépouillée. À l’aide de pinces stériles, retirez la cornée du milieu et rincez dans 1X PBS pour éliminer les milieux résiduels et les débris cellulaires.
Après le rinçage, placez le côté endothélial de la cornée sur le couvercle d’une boîte de Pétri. Trempez un nouveau poinçon de biopsie de quatre millimètres dans du bleu trypan dans un plat de soudure et tapotez l’excès. À l’aide des deux mains, positionnez le poinçon au-dessus du centre de la cornée et abaissez-le directement sur la surface endothéliale, en appliquant une pression minimale.
Sans changer la position ou la pression sur la cornée, déplacez le poinçon d’une main et atteignez les pinces avec la main nouvellement libre. Utilisez la pince pour maintenir la cornée en place tout en tordant doucement le coup de poing de biopsie à environ 90 degrés d’avant en arrière plusieurs fois. Soulevez le poinçon de biopsie directement de la cornée et réservez.
Rincer une fois de plus dans 1X PBS pour éliminer l’excès de bleu de trypan. Transférer la cornée sur le couvercle de la boîte de Petri dans une lunette de dissection. Maintenir la cornée en place avec une pince incurvée marque la membrane de Descemet en traînant légèrement la pointe d’une aiguille pointue de calibre 30 le long de l’anneau bleu trypan laissé par le poinçon de biopsie.
Utilisez une pression minimale pour éviter de perturber le stroma sous-jacent. Avec un crochet sinskey, utilisez des mouvements de ramassage doux pour soulever et décoller la membrane de Descemet autour du bord de la plaie. Travailler vers le centre de la lésion.
La membrane de Descemet devrait présenter très peu de résistance. Si vous éprouvez des difficultés, vous tirez probablement vers le haut stroma. Si cela se produit, recommencez, en soulevant à partir d’un nouveau point le long du bord de la plaie.
Une fois que la majorité de la membrane de Descemet a été séparée du stroma, utilisez des pinces Gorovoy pour retirer la membrane et la mettre de côté. Examinez la zone dépouillée à la recherche de tout morceau de membrane restant et retirez-la avec une pince Gorovoy. Après le décapage de Descemet, tachez la cornée avec du bleu trypan pour visualiser la zone de la plaie.
Rincez la cornée dans 1X PBS contenant 0,01% de chlorure de calcium et de chlorure de magnésium pour éliminer les débris cellulaires qui pourraient interagir avec le bleu de trypan et faciliter une adhésion étroite des CEC restants à la membrane intacte de Descemet. Placez la cornée dans un plat soudé et pipettez 30 microlitres de bleu trypan sur la couche endothéliale pendant 30 secondes. Utilisez des pinces pour bercer doucement la cornée afin de vous assurer que toute la surface endothéliale est couverte.
Rincez l’excès de bleu de trypan dans le PDS avec du calcium et du magnésium, et imagez la cornée colorée sous un microscope à dissection pour le point zéro du jour. Une fois cette procédure terminée, mettez en culture les cornées dans une plaque de six puits contenant un milieu faible en sérum composé des composants énumérés ci-dessous. Cultiver la cornée gauche dans huit moulins de milieux à faible teneur en sérum seul, et la cornée droite dans des milieux à faible teneur en sérum complétés par du FGF-1 modifié ou d’autres traitements d’essai souhaités.
Incuber les cornées à 37 degrés Celsius avec 6% de CO2 pendant 14 jours avec des changements quotidiens de milieu. Répétez la procédure de coloration au trypan les jours, trois, six, neuf, 12 et 14 et imagez chaque cornée immédiatement après la coloration. Assurez-vous de garder les paramètres de l’appareil photo cohérents à tous les points temporels.
Après la période de culture, des taches supplémentaires peuvent être effectuées sur les cornées en fonction des intérêts de recherche, particuliers à l’expérience. D’autres taches pertinentes pour les intérêts de recherche de notre laboratoire comprennent la coloration à l’alizarine, ainsi que la coloration fluorescente pour l’incorporation d’EDU et les protéines de jonction serrée ZO-1. La coloration à l’alizarine est effectuée pour visualiser les bordures cellulaires afin de confirmer les résultats de la coloration du trypan et de visualiser la morphologie cellulaire dans la zone guérie.
La coloration immunofluorescente ZO-1 permet de visualiser la formation de jonctions serrées entre les CEC, ce qui présente un intérêt particulier dans et autour de la zone guérie. Le marquage EdU est effectué comme une mesure qualitative pour confirmer que la prolifération contribue à la guérison et peut également être utilisé pour quantifier les cellules proliférantes dans certains contextes. Des instructions plus détaillées sur la façon d’effectuer ces procédures de coloration spécifiques sont incluses dans l’article correspondant à cette vidéo.
Voici des images représentatives d’une paire de cornées jugées dystrophiques par l’Eye-Bank qui ont été incubées avec ou sans le FGF-1 artificiel sur une période de 14 jours. Comme on le voit sur les images, la cornée traitée au FGF-1 a démontré une guérison accélérée par rapport à la cornée témoin non traitée. Une coloration supplémentaire de l’alizarine à la fin de la période de culture a servi à délimiter les bords cellulaires et a confirmé ces résultats.
Cette observation a été reproduite sur 11 paires de cornées dystrophiques pour valider le modèle dans un échantillon de cornée le plus pertinent pour la procédure clinique DSO. Un logiciel de traitement d’image, tel que ImageJ, peut être utilisé pour mesurer la zone tachée dans ces images afin de quantifier les progrès de la cicatrisation des plaies, comme on peut le voir ici. Toutes les cornées dystrophiques traitées avec du FGF-1 modifié ont montré une plus grande guérison au jour 14, par rapport au partenaire non traité, ce qui a entraîné une guérison moyenne de 91% contre 38% dans les cornées témoins.
Et cette différence était statistiquement significative. Une immunohistochimie supplémentaire visualisée par imagerie confocale a révélé une expression semi-organisée de la protéine de jonction serrée ZO-1, reflétant les modèles de coloration alizarine précédents. Le marquage EDU a confirmé la présence de cellules proliférantes dans et autour de la zone de la plaie et était visible à des niveaux plus élevés dans les cornées traitées par rapport aux témoins non traités.
Dans certaines paires de cornées, la mort de la CEC peut être visible périphérique à la zone de la plaie, en particulier dans les cornées dystrophiques. Voici des exemples d’images de cornées colorées au trypan présentant une mort importante des cellules périphériques. Comme on le voit sur les images, la mort des cellules périphériques se produit principalement à des moments antérieurs et s’inverse progressivement au cours de la période de culture.
Cette coloration périphérique peut compliquer la quantification de la zone de la plaie lorsqu’elle se connecte à la plaie, car il peut être difficile de déterminer l’emplacement du bord de la plaie. Cependant, dans tous les cas, la coloration périphérique du trypan s’est suffisamment dissipée pour produire des images mesurables au dernier jour 14. Nous pensons que ce phénomène est unique aux cornées de donneurs cultivées ex vivo et n’est pas pertinent pour les cornées humaines in vivo.
Comme les dommages à l’endothélium périphérique n’ont été rapportés dans aucune étude de cas clinique de DSO à notre connaissance. Un deuxième motif de coloration appelé coloration lointaine a été capturé dans les images rouge Alizarin, mais était également apparent dans les images bleu trypan tout au long de la période de culture. Cette observation est caractérisée par un anneau de coloration sombre autour du limbe indiquant un endothélium compromis.
Malgré le terme, ce schéma était si fréquent dans les cornées normales et dystrophiques qu’elles n’ont pas été considérées comme positives pour la coloration périphérique. Ce protocole nous a permis de démontrer de meilleurs résultats de guérison dans les cornées cultivées traitées avec du FGF-1 artificiel après le décapage de Descemet. En outre, ce protocole de décapage constitue une méthode précieuse pour d’autres chercheurs qui étudient le DSO et peut être utilisé pour une grande variété d’applications, notamment pour tester d’autres thérapies de cicatrisation des plaies, évaluer les modifications apportées à la technique chirurgicale et comparer la guérison à différentes populations de donneurs ou stades de la maladie.
Nous espérons que cette recherche et d’autres recherches utilisant ce protocole encourageront les cliniciens à considérer le DSO comme une option de traitement précieuse pour leurs patients FECD éligibles à l’avenir.
