Ce protocole offre une méthode d’administration de thérapie génique à plusieurs tissus oculaires d’une manière sûre, facile et efficace. Il est également adaptable pour les injections intrastromales et sous-rétiniennes chez les petits animaux. L’utilisation de la voie d’injection sous-conjonctivale est peu invasive.
Il présente moins de risques et est très prometteur pour l’administration AV pour traiter plusieurs maladies oculaires. Avec plus de 1 milliard de personnes dans le monde souffrant de déficience visuelle, l’utilisation d’une méthode sûre et facile pour l’administration de médicaments offre une large applicabilité pour le traitement de nombreuses causes différentes de cécité. Les méthodes d’administration de gènes décrites dans ce protocole présentent un intérêt particulier pour ceux qui développent des stratégies d’intervention potentielles et les ophtalmologistes praticiens, qui finiront par administrer ces médicaments aux patients.
Le plus grand défi pour quelqu’un qui exécute ce protocole pour la première fois est probablement l’insertion de l’aiguille dans l’espace conjonctival conceptuel. Pour commencer, assemblez le système d’injection en plaçant un stéréomicroscope et une pompe à seringue dans une armoire de biosécurité. Ensuite, coupez le tube en polyéthylène à une longueur d’environ 50 centimètres.
Insérez l’extrémité d’une aiguille de calibre 36 dans une extrémité du tube. Ensuite, remplissez une seringue jetable de 3 millilitres avec de l’eau stérile et insérez-la dans le côté du tube opposé à l’aiguille. Rincez le tube trois fois, en alternant entre de l’eau stérile et de l’alcool à 70% pour désinfecter le tube et vous assurer qu’il n’y a pas de fuites, de sabots ou de dommages dans tout le tube.
À l’aide de la seringue jetable de 3 millilitres, remplissez le tube avec de l’eau stérile et laissez le tube attaché à la seringue jetable. Ensuite, placez un morceau de paramousse sur la surface de l’armoire de biosécurité et ajoutez-y une piscine d’eau stérile. Immergez la partie du tube reliée à l’aiguille dans la piscine d’eau stérile.
Ensuite, retirez la seringue jetable de l’ouverture du tube pour empêcher tout air de pénétrer dans le système de tubulure lors du retrait de la seringue. Remplissez ensuite une seringue Hamilton de 10 microlitres avec de l’eau stérile. Ensuite, connectez l’aiguille de la seringue Hamilton à l’extrémité ouverte du tube en immergeant l’extrémité de l’aiguille de la seringue Hamilton dans la flaque d’eau stérile sur le film para.
Appuyez sur le bouton d’inversion rapide sur l’écran de la pompe et maintenez-le enfoncé pour déplacer les blocs poussoirs à la longueur approximative de la seringue. Ensuite, dévissez les boutons de serrage du support pour desserrer les supports de fixation du poussoir et des blocs porte-seringues. Ensuite, chargez la seringue Hamilton sur le bloc porte-seringue et fixez la seringue en suivant les instructions du fabricant.
Pour régler les paramètres dans l’écran de réglage de la pompe, appuyez sur le bouton Forcer et réglez le niveau de force à 30%Puis acceptez les modifications pour revenir à l’écran de réglage. Appuyez sur le bouton Démarrage rapide, sélectionnez Méthode, puis sélectionnez l’option Infuser uniquement. Pour l’option seringue, sélectionnez Hamilton 1700, puis cliquez sur Glass et sélectionnez 10 microlitres.
Plus tard, sélectionnez le débit de perfusion et le volume d’injection. Éjectez l’eau de la seringue Hamilton tout en laissant la tubulure et l’aiguille d’injection pleines d’eau en appuyant sur le bouton Infuse. Ensuite, retirez le virus en plaçant l’aiguille d’injection dans une partie aliquote du stock de virus.
Ensuite, tirez légèrement sur la seringue Hamilton en appuyant sur le bouton inverse pour introduire une petite bulle d’air dans le tube. Après avoir anesthésié l’animal, saisissez la conjonctive avec une pince. Insérez ensuite l’aiguille dans la conjonctive jusqu’à ce que le biseau soit entièrement recouvert par la membrane conjonctivale, et posez l’aiguille contre le globe.
Simultanément, lancez l’injection en appuyant sur le bouton Start à l’aide de la pédale de commande. Pour examiner la distribution du vecteur AAV, les tissus oculaires et environnants ont été colorés avec de l’hématoxyline et de l’éosine. Les coupes sagittales représentatives ont démontré que la dispersion de l’encre de Chine se produisait principalement à côté des muscles extraoculaires de la surface externe de la sclérotique dans les tissus conjonctifs lâches périoculaires.
Pour confirmer la transduction de l’AAV 8 auto-complémentaire huit semaines après l’injection, l’abondance des protéines de fluorescence verte dans les coupes transversales a été examinée par coloration par immunofluorescence. Les résultats ont révélé que les vecteurs AAV 8 transduisaient efficacement les muscles périoculaires postérieurs à l’œil et à la cornée. Pour analyser la biodistribution du vecteur, le nombre de copies du génome du vecteur et les compartiments oculaires distincts dans d’autres organes, y compris le foie et le cœur, ont été examinés par réaction en chaîne de la polymérase quantitative à l’aide d’amorces et de sondes spécifiques au transgène.
L’expression du transgène a été confirmée par une réaction en chaîne de la polymérase quantitative de transcription inverse, qui suggère que l’injection sous-conjonctivale d’AAV 8 entraîne l’expression du transgène dans la paupière, la conjonctive, la cornée et le nerf optique. La bulle d’air servira de barrière entre l’eau dans le tube et le médicament thérapeutique. Cette technique permet à d’autres chercheurs d’explorer l’utilisation de la voie d’administration sous-conjonctivale pour les solutions ophtalmiques et les thérapies géniques oculaires pour de multiples maladies.
