L’absorption du glucose est la clé pour comprendre la santé et la maladie. Comme le glucose joue un rôle central dans les demandes métaboliques et structurelles dans le corps humain, ainsi que jouer un rôle vital dans la régulation. La mesure extracellulaire du glucose permet le développement de tests à haut débit pour la cinétique de l’absorption du glucose dans les cellules, les tissus et les organes de différents antécédents génétiques en réponse à des nutriments ou des médicaments.
Ce test serait un outil précieux pour la découverte de thérapies et de nutrition pour le diabète, le cancer, les maladies dégénératives du système nerveux central, l’obésité et toutes les maladies du glucose et du métabolisme. Le test nécessite un ajustement du temps de famine et de stimulation qui devrait être basé sur les spécificités métaboliques pour différents tissus et cultures cellulaires. Culture de fibroblastes de souris 3T3-L1 par placage de 10 à 6 cellules, dilués dans 20 millilitres de plaques de milieu 1 sur 296 puits.
Plaquer 100 microlitres de suspension cellulaire par puits, en veillant à maintenir l’homogénéité de cette suspension par mélange. Cultiver des cellules pendant 48 heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius sans changer de milieu jusqu’à environ 70 à 80% de confluence. Maintenir les cellules confluentes et à jeun en les cultivant dans le même milieu pendant 48 heures.
Variez le temps d’incubation de 24 à 72 heures, en fonction de l’état catabolique de jeûne souhaité. Décanter les fluides des cellules dans les plaques de 96 puits. Absorber le liquide restant à l’aide d’essuie-tout stériles.
Rincez la plaque de 96 puits avec 100 microlitres de PBS par puits et absorbez le liquide restant avec des serviettes en papier stériles. Ajouter 100 microlitres de DMEM sans glucose par puits et incuber pendant 40 minutes. Ajustez le temps d’incubation en fonction des stimuli de type cellulaire et du niveau de jeûne souhaité.
Utilisez huit répétitions pour chaque condition de simulation. Par conséquent, préparez un millilitre pour chaque condition de simulation. Utilisez sept conditions de simulation sans insuline.
Glucose FD de 2,5 microgrammes par millilitre, 1 microgramme par millilitre, 0,5 microgramme par millilitre, 0,2 microgramme par millilitre, 0,1 microgramme par millilitre, 0,05 microgramme par millilitre et 0 milligramme par millilitre dans une plaque de 196 puits. Utilisez sept conditions de stimulation avec de l’insuline. Glucose FD de 2,5 microgrammes par millilitre, 1 microgramme par millilitre, 0,5 microgramme par millilitre, 0,2 microgramme par millilitre, 0,1 microgramme par millilitre, 0,05 microgramme par millilitre et 0 microgramme par millilitre dans une autre plaque de 96 puits.
Pour préparer les conditions de stimulation, diluer un microlitre de solution de travail de glucose FD de cinq milligrammes par millilitre et 999 microlitres de DMEM sans glucose pour obtenir un millilitre de solution de travail. À l’aide de cette solution de bouillon de travail, préparez 1 à 2000, 1 à 5 000, 1 à 10 000, 1 à 25 000, 1 à 50 000 et 1 à 100 000 délires de glucose FD pour obtenir 2,5 microgrammes par millilitre, 1 microgramme par millilitre, 0,5 microgramme par millilitre, 0,2 microgramme par millilitre, 0,1 microgramme par millilitre, 0,05 microgramme par millilitre dans des tubes de deux millilitres immédiatement avant les expériences dans une armoire de biosécurité sans lumière. Ajoutez un microlitre d’insuline à chacune de ces conditions.
Après 40 minutes d’incubation, décanter le DMEM sans glucose de chaque puits dans des plaques de 96 puits et absorber le liquide restant avec des serviettes en papier stériles. Ajouter 100 microlitres chacun des diverses conditions de traitement décrites précédemment, dans des puits le long d’une colonne. Et 100 microlitres de la même condition de traitement aux puits le long de la rangée dans les deux plaques murales 96.
Étiquetez les plaques qui ont utilisé les conditions, avec et sans insuline. Ajouter du DMEM sans glucose seul aux puits de contrôle. Incuber la plaque pendant 40 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire dans l’obscurité.
Après que les cellules ont été stimulées pendant 40 minutes. Transférer le milieu de stimulation des deux plaques dans de nouvelles plaques de 96 puits, en conservant la même disposition expérimentale. Lavez les cellules avec du PBS.
Retirer le PBS et décanter toute solution restante sur des serviettes en papier stériles. Ajouter un inhibiteur de protéase au tampon de dosage de radio-immunoprécipitation pour protéger les protéines. Placer les plaques contenant le test de radioimmunoprécipitation dans un agitateur pendant 30 minutes.
À l’aide d’un lecteur de microplaques, mesurer la fluorescence aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission à 485 et 535 nanomètres respectivement. D’abord dans le milieu contenant du glucose FD extracellulaire, puis dans la plaque avec des cellules testées par radioimmunoprécipitation au terme d’une incubation de 30 minutes. Effectuer le dosage des protéines BCA conformément aux instructions du fabricant.
Quantifier les concentrations de protéines dans chaque puits contenant des cellules testées par radio-immunoprécipitation. Utiliser 10 microlitres de l’homogénat du test de radioimmunoprécipitation, mesurer les concentrations de protéines et tripler pour augmenter la précision des mesures dans 96 plaques de puits. Quantifier les protéines en fonction des étalons protéiques analysés avec des échantillons sur chaque plaque de 96 puits.
Incuber les tissus ou organes prélevés dans une plaque à six puits contenant du PBS pendant une minute. Manipulez chaque tissu ou organe dans un puits séparé. Après une minute, placez chaque tissu sur une serviette en papier stérile pour absorber le PBS.
Transférer les tissus ou les organes dans une plaque séparée de six parois contenant 4 000 microlitres de DMEM sans glucose et incuber pendant deux minutes. Après deux minutes, retirer et transférer les tissus dans les puits d’une plaque à six puits contenant 0,29 solution de travail de glucose FD millimolaire. Incuber les six plaques de puits contenant des tissus dans une solution de travail de glucose FD à 37 degrés Celsius.
Recueillir 100 microlitres de solution de travail de glucose FD de chaque puits après 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 et 120 minutes d’incubation, et transférer les 100 microlitres de solution de travail de glucose FD collectés dans 96 plaques de puits pour analyser la cinétique de l’épuisement du glucose FD extracellulaire. Agiter avant et après la collecte. Mesurer la fluorescence à l’excitation dans les longueurs d’onde d’émission à 485 et 535 nanomètres respectivement à l’aide d’un lecteur de microplaques.
La dépendance à la dose dans l’absorption intracellulaire du glucose FD a été significativement augmentée en présence d’insuline. La stimulation par l’insuline a entraîné une diminution significative des taux de glucose FD extracellulaire par rapport aux échantillons sans stimulation par l’insuline. L’épuisement extracellulaire du glucose FD peut mesurer un changement dans l’absorption du glucose avec une précision comparable à l’absorption intracellulaire du glucose FD.
Le glucose FD extracellulaire n’a pas été épuisé dans la graisse viscérale témoin non stimulée pendant 120 minutes d’incubation. En revanche, le prétraitement de souris avec de l’insuline ou de l’AAC2 avant la dissection a entraîné une déplétion significative du glucose FD extracellulaire dans un intervalle de temps de 30 minutes et 60 minutes respectivement. Le glucose FD extracellulaire n’a pas été appauvri dans les explants hépatiques stimulés par l’insuline, par rapport aux explants hépatiques non stimulés.
Le glucose FD extracellulaire a été significativement diminué de manière dépendante du temps, et des explants hépatiques prétraités avec une déplétion de glucose AAC2,22% ont été observés dans le milieu extracellulaire contenant le cerveau non traité après 60 minutes d’incubation. Le milieu incubé avec le cerveau de souris traitées à l’insuline a montré une diminution linéaire de 5% du glucose FD. Les cerveaux stimulés par AAC2 ont entraîné une diminution rapide et profonde à 67,4% du glucose FD extracellulaire au cours des 20 premières minutes.
Les substances impliquant le lavage sont particulièrement importantes pour éliminer les traces de glucose, de sang ou de sérum dans les milieux et/ou les organes, car elles peuvent interférer avec la lecture de fluorescence de ces milieux. Après un haut débit, l’identification des composés de métabolites dans les gènes ayant des propriétés glycémiques, ainsi que les conditions optimales pour leur action in vivo, des expériences pourraient être validées par le glucose FD marqué et le balayage TEP pour confirmer l’accumulation de glucose dans des organes spécifiques. Cette technique de découverte de l’action glycémique est à la fois bénéfique dans la délétion de nombreux métabolites, thérapeutiques ou leurs combinaisons, et met en évidence leurs actions dans différents organes.
