Nous sommes reconnaissants au Dr Thierry Pourcher pour nous permettre d&#39;utiliser le spectromètre de fluorescence et pour son aide. Le laboratoire est financé par la Nationale Contre le Cancer le Ligue (Equipe de labellisée), l&#39;Association pour la Recherche contre le cancer, l&#39;Institut National du Cancer (INCa), l&#39;Agence Nationale pour la Recherche, METOXIA (programme FP7), le Centre A. Lacassagne, le Centre National de la Recherche Scientifique, l&#39;Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale et l&#39;Université de Nice ( <a href="http://www.unice.fr/isdbc/" target="_blank">http://www.unice.fr/isdbc/</a> ). Nous remercions le Dr Christiane M Brahimi-Horn pour la lecture critique et correction rédactionnelle.

Titration biochimique de glycogène Une. Lyse cellulaire <ol><li> cellules de semences à une concentration de 0,5-2 x 10 6 par boîte de 100 mm de diamètre. </li><li> Traitement: incuber les cellules 24, 48, ou 72 heures de la concentration d&#39;oxygène basse (hypoxie) dans un Bug-Box station de travail anaérobie (Ruskinn technologie Biotrace International Plc, Bridgend, UK) fixé à 1% ou 0,1% O 2, 94% ou 94,9% de N 2 et 5% de CO 2. En parallèle, les cellules incuber à la normoxie (21% O 2, 5% CO 2). Changer le milieu (milieu 25 mM contenant du glucose) toutes les 24 heures afin de minimiser les variations de la concentration de glucose au cours du temps de l&#39;expérience. </li><li> Après traitement, les cellules de lavage 2 fois avec du PBS pour éliminer les traces de glucose du milieu de culture. Grattez les cellules dans du PBS froid. </li><li> Centrifuger la solution à 1000 rpm pendant 5 min, jeter le surnageant et laver le culot une fois avec PBS. Le culot peut être congelé à -20 ° C avant de poursuivre.</li><li> Remettre en suspension le culot dans 100 pl d&#39;eau distillée. Ajouter 100 ul de tampon d&#39;hydrolyse du glycogène fournies avec le kit d&#39;analyse de glycogène (Abcam). Faire bouillir le lysat à 95 ° C pendant 5 min pour inactiver les enzymes. </li><li> Vortex et centrifuger le lysat à 13 000 rpm pendant 10 min pour éliminer les produits insolubles. Gardez le surnageant. </li><li> Pour normaliser les taux de glycogène de la teneur en protéines entre les échantillons, la quantification des protéines peut être effectuée avec 25 à 35 ul du surnageant en utilisant le test à l&#39;acide bicinchoninique (BCA-Interchim). </li></ol> Une partie du lysat peut être utilisé pour mesurer la concentration de glucose libre dans les cellules. 2. L&#39;hydrolyse du glycogène <ol><li> Mélanger 50 ul de surnageant (étape 1) avec 1 pi de l&#39;hydrolyse enzymatique de mélange. Ce mélange contient glucoamylase. Incuber pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Préparer la courbe de calibration par dilution de la glycogène standard (2 mg / ml) supplied avec le kit pour une solution de 10 ug / ml dans le tampon d&#39;hydrolyse. Ensuite, préparer six tubes séparés avec 0, 4, 8, 12, 16, et 20 pi de 10 pg / ml standards et ajuster chaque tube à un volume final de 50 ul avec du tampon d&#39;hydrolyse pour donner une concentration de glycogène de 0, 0,04 , 0,08, 0,12, 0,16 et 0,2 ug / ml. Ajouter 1 pi de mélange d&#39;hydrolyse enzymatique dans les normes et incuber pendant 30 min à température ambiante. </li></ol> La concentration de glucose dans le fond de la lignée cellulaire, donnée par la valeur de la concentration libre de glucose, doit être soustraite de la valeur de la concentration en glucose total (glucose à partir du glycogène hydrolyse + glucose libre) pour déterminer le niveau de glycogène dans la cellule. 3. Développement et de la lecture de la fluorescence <ol><li> Pour chaque condition, préparer un tube (tube 1) pour mesurer la concentration de glucose libre et deux tubes (tubes 2 et 3) pour mesurer la concentration totale en glucose (chaque esprit du tubeha différente volume de glycogène hydrolysé). </li><li> Ajouter 15 ul de surnageant extraites à la fin de l&#39;étape 1 dans le tube 1. Ajouter 35 ul de tampon d&#39;hydrolyse pour compléter à un volume final de 50 ul. Fluorescence obtenue va donner la concentration en glucose libre. </li><li> Ajouter X pi de glycogène hydrolysées (obtenu à l&#39;étape 2) dans le tube 2. Ajuster à un volume final de 50 ul. Volume de l&#39;échantillon (X ul) doit être ajusté en fonction de la densité cellulaire et / ou du type de cellule afin d&#39;obtenir des valeurs de fluorescence qui ne sont pas au-delà de la concentration de la courbe d&#39;étalonnage. </li><li> Ajouter 2 X pi de glycogène hydrolysé dans le tube 3. Ajuster à un volume final de 50 ul. </li><li> Préparer une solution de développement pour les échantillons et les normes en mélangeant pour chaque tube 48,7 ul de tampon de développement, 1 pl de développement Enzyme Mix et 0,3 pi de OxiRed Probe (fourni dans le kit d&#39;analyse de glycogène). Par exemple, pour deux conditions, préparer un mélange de 12 tubess (6 pour les normes, 2 pour le glucose libre et 4 pour la fluorescence totale de glucose). </li><li> Ajouter 50 ul de ce mélange à chaque tube et incuber pendant 30 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Mesurer la fluorescence à une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 535 nm, une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 587 nm comme recommandé, et une fente de 3 nm pour l&#39;excitation et d&#39;émission. </li></ol>

<ol>
	<li>Pelletier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+Synthesis+is+Induced+in+Hypoxia+by+the+Hypoxia-Inducible+Factor+and+Promotes+Cancer+Cell+Survival.">Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival.</a> Front Oncol. 2, (2012).</li><li>Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+look+at+the+biogenesis+of+glycogen.">A new look at the biogenesis of glycogen.</a> FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).</li><li>Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+features+of+glycogen+metabolism+in+the+liver.">Specific features of glycogen metabolism in the liver.</a> Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).</li><li>Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMP-activated+protein+kinase+does+not+associate+with+glycogen+alpha-particles+from+rat+liver.">AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).</li><li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+alpha+and+beta+particles+in+glycogen+using+molecular+size+distributions.">Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions.</a> Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).</li><li>Chee, N. P., Geddes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+liver+glycogen.">The structure of liver glycogen.</a> FEBS Lett. 73, 164-166 (1977).</li><li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism:+some+new+developments+and+old+themes.">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochem. J. 441, 763-787 (2012).</li><li>Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+metabolism+in+the+normal+red+blood+cell.">Glycogen metabolism in the normal red blood cell.</a> Blood. 40, 836-843 (1972).</li><li>Agbanyo, M., Taylor, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+3-deoxy-3-fluoro-D-glucose+into+glycogen+and+trehalose+in+fat+body+and+flight+muscle+in+Locusta+migratoria.">Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria.</a> Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).</li><li>Louzao, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Fluorescent+glycogen"+formation+with+sensibility+for+in+vivo+and+in+vitro+detection.">"Fluorescent glycogen" formation with sensibility for in vivo and in vitro detection.</a> Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).</li><li>Sheehan, D. C. H., B, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histotechnology. , (1980).</li><li>Baba, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibody+that+recognizes+glycogen+and+its+application+for+immunohistochemistry.">Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry.</a> Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).</li></ol>

Les auteurs déclarent aucun conflit d&#39;intérêt.

Titrage biochimique de glycogène in vitro permet une quantification précise des cellules contenu glycogène. Comparé à d&#39;autres techniques (PAS, immunofluorescence avec un anticorps de glycogène, etc.), Ce titrage est très spécifique, sensible et reproductible. En outre, le procédé est commode car il ne nécessite pas de radioactivité, mais un spectromètre à fluorescence. Cependant, cette technique est purement quantitative et ne fournit pas d&#39;informations sur la distribution de gly...

Le glycogène est un polymère multibranche de résidus de glucose, qui est présent dans le cytoplasme de nombreux types de cellules. Elle est l&#39;une des principales formes de stockage d&#39;énergie dans les cellules et joue un rôle important dans le métabolisme du glucose. La plupart des cellules de mammifères sont capables de produire et stocker du glycogène, qui peut être rapidement dégradé en glucose pour promouvoir la glycolyse et de l&#39;ATP production au cours du stress métabolique. Les hépatocytes produisent des quantités massives de glycogène pour réguler le niveau de sucre sanguin fournissant ainsi une alimentation continue en glucose dans le corps. En revanche, la concentration de glycogène dans les autres cellules (muscles, les globules rouges, etc) est relativement faible. Cependant, localement, ces quantités sont suffisantes pour fournir de l&#39;énergie à court terme quand les cellules sont soudainement exposés à un environnement privé de nutriments. la synthèse de glycogène et la dégradation du glycogène suit les mêmes étapes dans tous les tissus (Figure 1). Tout d&#39;abord, le glucosepénètre dans les cellules par des transporteurs du glucose (GLUT), et est rapidement transformé à partir de glucose-6-phosphate (G6P) en glucose-1-phosphate (G1P) par phosphoglucomutase. G1P est alors modifiée en UDP-glucose et le carbone C1 de l&#39;UDP-glucose est attaché à un résidu de tyrosine de glycogénine, la protéine d&#39;ancrage de glycogène. Cette molécule, considérée comme une amorce de glycogène, est prolongée par la fixation de l&#39;UDP-glucose au glucose terminal par un α (1 → 4) liaison via la glycogène synthase. Enfin, quand une chaîne linéaire de plus de 11 résidus de glucose est formée, l&#39;enzyme de branchement transmet une borne oligosaccharide constitué par un minimum de six résidus glucose glucose à l&#39;autre de la chaîne à proximité par le biais d&#39;une α (1 → 6) de liaison. La répétition de ce processus donne une structure massive fractale contenant branches qui forment une hélice avec 6,5 glucose par tour. Le glycogène peut être inverse hydrolysé en glucose par l&#39;action concertéede déramification enzymes qui hydrolysent l&#39;α (1 → 6) et lié glycogène phosphorylase qui hydrolyse l&#39;α (1 → 4) lié glycosidique entre le dernier résidu de glucose et une branche de la molécule de glycogène. Cette réaction appelé glycogénolyse est activée en augmentant les niveaux d&#39;AMP (reflétant la consommation d&#39;ATP), et inhibée par le glucose et l&#39;ATP 2,3. Par microscopie électronique, les molécules de glycogène ont été décrits dans de nombreux types cellulaires que les particules libres (ou β monoparticules de glycogène) de 15 à 30 nm de diamètre. Dans des types cellulaires spécifiques, telles que les hépatocytes, les particules β peuvent être assemblés en un ensemble pour former des rosettes, également connus en tant que particules α qui varient en diamètre de 80 nm à un maximum de 200 nm 4 </sup&gt;. La manière dont ces particules β sont liés pour former de plus grands agglomérats de particules α n&#39;est pas encore totalement élucidé. Certaines preuves tend à prouver que les particules β peuvent être liés par liaison covalente 5, une liaison hydrogène, ou encore au moyen d&#39;interactions protéine-protéine 6. La quantité de glycogène dans les cellules dépend de nombreux paramètres: (I) la quantité de glycogénine dans la cellule qui initie la synthèse du glycogène, (II) l&#39;activité de la glycogène synthase et phosphorylase régulée par la phosphorylation des protéines / déphosphorylation, (III) la concentration du glucose dans les cellules, ce qui est dépendante de plusieurs paramètres, tels que la fourniture de glucose à partir du système vasculaire et de la captation du glucose par les cellules. les réserves de glycogène sont strictement réglementées par régulation allostérique d&#39;hormones biosynthétiques par les métabolites intermédiaires, par des hormones de régulation du métabolisme énergétique, et par des éléments nutritifs de détection de signalisation des voies 7. Il est important d&#39;êtremesure de quantifier le glycogène dans des échantillons biologiques afin de mieux comprendre l&#39;importance du métabolisme du glycogène dans le corps entier et au niveau cellulaire. Nous décrivons ici un biochimique précis, reproductible et pratique dans le test in vitro pour le glycogène. Cette technique est basée sur la quantification de la fluorescence du glucose avant et après l&#39;hydrolyse spécifique de glycogène. D&#39;autres méthodes existent pour estimer le niveau de glycogène dans les cellules, mais la plupart d&#39;entre eux ne sont pas quantitatifs. Une des premières techniques décrites pour la quantification de glycogène dans les cellules était basée sur la mesure de la [14C]-glucose en glycogène 8,9 incorporation. L&#39;utilisation de la radioactivité qui rend ce procédé plus difficile à manipuler mais elle a l&#39;avantage d&#39;offrir le taux d&#39;incorporation du glucose dans le glycogène et à faire la distinction entre la distribution des résidus de glucose sur les branches extérieures et dans le noyau de la molécule (elle nécessite également un supplémentaire β-amylolysis et une étape de chromatographie). Une autre technique a été développée plus récemment et est basé sur l&#39;incorporation de 2-NBDG (2 - {N-[7-nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazole-4-yl] amino}-2-désoxyglucose), un 2-désoxyglucose dérivé fluorescent, en glycogène 10. L&#39;intensité de fluorescence mesurée reflète la quantité de glycogène produit et peut être mesurée avec un lecteur de fluorescence. La distribution de la fluorescence de la cellule peut aussi être évaluée par microscopie confocale. Parmi les autres techniques non quantitatives, l&#39;acide périodique de Schiff coloration (PAS) est peut-être le plus commun. Il peut être utilisé pour la détection de glycogène dans les cellules fixées, les coupes de tissu dans de la paraffine ou de gelée. Cette histologiques couleurs de technique non spécifiquement polysaccharides, des glycolipides, des glycoprotéines, la cellulose et les mucines neutres en violet. La spécificité de ce test peut être augmentée par le traitement des cellules fixes ou des sections de tissu avec diastase, qui digère spécifiquement le glycogène. Par la suite,le niveau de glycogène peut être estimée qualitativement en comparant des échantillons non hydrolysées (tous les hydrates de carbone modifié de macromolécules) à des échantillons hydrolysées (glucides macromolécules modifié, sauf glycogène). La coloration et l&#39;analyse microscopique, à la différence des essais biochimiques de glycogène, fournit des informations concernant la distribution de glycogène dans la cellule, qui peut être diffusé ou concentré dans une certaine partie de la cellule. Cependant, même si les estimations de coloration PAS des différences dans l&#39;accumulation de glycogène entre des conditions différentes, il n&#39;est pas quantitative 11. Un anticorps monoclonal de souris à l&#39;origine faite en utilisant cartilage condylien mandibulaire a été montré que l&#39;antigène de réagir avec du glycogène dans les cellules et à la glycogène purifiée in vitro 12. Comme cet anticorps reconnaît spécifiquement des chaînes de sucres liées glycogène, il est un outil utile pour la détection de glycogène par immunohistochimie d&#39;une manière plus précise que la coloration PAS. </p&gt; La microscopie électronique est une autre technique qui permet la visualisation des grains de glycogène dans les cellules et l&#39;évaluation du degré de stockage du glycogène. En fait, les particules β de glycogène sont facilement reconnaissables avec un microscope électronique en électrons granules denses 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31966.047</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glycogen Assay Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab65620 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		<tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
	 </tr>
		 <tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>LS 50B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

biochemical titration of glycogen in vitro

Le glycogène est le principal polymère énergétique de glucose chez les animaux vertébrés et joue un rôle essentiel dans le métabolisme du corps tout entier, ainsi que dans le métabolisme cellulaire. Beaucoup de méthodes de détection glycogène existent déjà, mais seulement quelques-uns sont d&#39;ordre quantitatif. Nous décrivons ici un procédé utilisant la trousse de dosage Abcam glycogène, qui est basé sur la dégradation spécifique du glycogène en glucose par la glucoamylase. Le glucose est ensuite oxydé spécifiquement à un produit qui réagit avec la sonde OxiRed pour produire la fluorescence. Le titrage est précise, sensible et peut être réalisé sur des extraits cellulaires ou des coupes de tissus. Cependant, contrairement à d&#39;autres techniques, elle ne donne pas d&#39;informations sur la distribution de glycogène dans la cellule. Comme exemple de cette technique, nous décrivons ici le titrage de glycogène dans les deux lignées cellulaires, les Chinois CCL39 de fibroblastes de poumon de hamster et LS174 de carcinome du côlon humain, incubées en normoxie (21% O 2) par rapport à l&#39;hypoxie (1% d&#39;O 2). Nous émettons l&#39;hypothèse que l&#39;hypoxie est un signalnal qui prépare les cellules à synthétiser et stocker du glycogène pour survivre 1.

Un faible niveau d&#39;oxygène (hypoxie) dans les signaux de tumeurs à cellules de tumeur de la nécessité de stocker de l&#39;énergie pour gérer la suite épuisement des nutriments, de façon à survivre. Sous forme de glycogène est la principale polymère énergétique du glucose dans les cellules de mammifères, nous avons étudié la régulation de stockage de glycogène dans l&#39;hypoxie. Le calcul et la normalisation de la concentration de glycogène dans les lysats cellulaires doivent être réalisées sur...

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Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Nous décrivons ici une méthode biochimique précis, reproductible et pratique pour le titrage de glycogène in vitro. Cette technique utilise la trousse de dosage Abcam glycogène et est basé sur l&#39;hydrolyse successive du glycogène en glucose et glucose titrage par fluorescence.

Titration biochimique de glycogène<em&gt; In vitro</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

28.2K vues.  University of Nice - Sophia Antipolis.  Nous décrivons ici une méthode biochimique précis, reproductible et pratique pour le titrage de glycogène in vitro. Cette technique utilise la trousse de dosage Abcam glycogène et est basé sur l'hydrolyse successive du glycogène en glucose et glucose titrage par fluorescence. 

Vidéo: Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.

In this video, we demonstrate an alternative method for detection and titering of viruses using an enzymatic antigen detection technique known as an immunoperoxidase assay. Here, we will show you how to collect your viral samples, prepare the cells for testing, and finally the immunoperoxidase assay using serial dilutions to determine the viral titer.

Le titrage de coronavirus humains en utilisant un dosage immunoperoxydase

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

Recherche

Biologie

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

Injection Zebrafish ventricule cérébral

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host macromolecule. ITC has some advantages over common spectroscopic approaches for studying host/ligand interactions. For example, the heat released or absorbed when the two components interact is directly measured and does not require any exogenous reporters. Thus the binding enthalpy and the association constant (Ka) are directly obtained from ITC data, and can be used to compute the entropic contribution. Moreover, the shape of the isotherm is dependent on the c-value and the mechanistic model involved. The c-value is defined as c = n[P]tKa, where [P]t is the protein concentration, and n is the number of ligand binding sites within the host. In many cases, multiple binding sites for a given ligand are non-equivalent and ITC allows the characterization of the thermodynamic binding parameters for each individual binding site. This however requires that the correct binding model be used. This choice can be problematic if different models can fit the same experimental data. We have previously shown that this problem can be circumvented by performing experiments at several c-values. The multiple isotherms obtained at different c-values are fit simultaneously to separate models. The correct model is next identified based on the goodness of fit across the entire variable-c dataset. This process is applied here to the aminoglycoside resistance-causing enzyme aminoglycoside N-6'-acetyltransferase-Ii (AAC(6')-Ii). Although our methodology is applicable to any system, the necessity of this strategy is better demonstrated with a macromolecule-ligand system showing allostery or cooperativity, and when different binding models provide essentially identical fits to the same data. To our knowledge, there are no such systems commercially available. AAC(6')-Ii, is a homo-dimer containing two active sites, showing cooperativity between the two subunits. However ITC data obtained at a single c-value can be fit equally well to at least two different models a two-sets-of-sites independent model and a two-site sequential (cooperative) model. Through varying the c-value as explained above, it was established that the correct binding model for AAC(6')-Ii is a two-site sequential binding model. Herein, we describe the steps that must be taken when performing ITC experiments in order to obtain datasets suitable for variable-c analyses.

ITC is a powerful tool for studying the binding of a ligand to its host. In complex systems however, several models may fit the data equally well. The method described here provides a means to elucidate the appropriate binding model for complex systems and extract the corresponding thermodynamic parameters.

Collecte variable de concentration isotherme ensembles de données de titrage calorimétrique afin de déterminer des mécanismes de liaison

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of molecular events and therapeutic strategies as well as for evaluating the physiological mechanisms of some pathologies1. 
There are relatively few publications related to adult zebrafish physiology of organs and systems2, which may lead researchers to infer that the basic techniques needed to allow the exploration of zebrafish systems are lacking3. Hematologic biochemical values of zebrafish were first reported in 2003 by Murtha and colleagues4 who employed a blood collection technique first described by Jagadeeswaran and colleagues in 1999. Briefly, blood was collected via a micropipette tip through a lateral incision, approximately 0.3 cm in length, in the region of the dorsal aorta5. Because of the minute dimensions involved, this is a high-precision technique requiring a highly skilled practitioner. The same technique was used by the same group in another publication in that same year6. In 2010, Eames and colleagues assessed whole blood glucose levels in zebrafish7. They gained access to the blood by performing decapitations with scissors and then inserting a heparinized microcapillary collection tube into the pectoral articulation. They mention difficulties with hemolysis that were solved with an appropriate storage temperature based on the work Kilpatrick et al.8. When attempting to use Jagadeeswaran's technique in our laboratory, we found that it was difficult to make the incision in precisely the right place as not to allow a significant amount of blood to be lost before collection could be started. 
Recently, Gupta et al.9 described how to dissect adult zebrafish organs, Kinkle et al.10 described how to perform intraperitoneal injections, and Pugach et al.11 described how to perform retro-orbital injections. However, more work is needed to more fully explore basic techniques for research in zebrafish.
The small size of zebrafish presents challenges for researchers using it as an experimental model. Furthermore, given this smallness of scale, it is important that simple techniques are developed to enable researchers to explore the advantages of the zebrafish model.

This paper presents a technique for collection of blood from the dorsal aorta of Zebrafish. It also provides instructions for obtaining serum for use in biochemical analyses, such as tests for determining cholesterol and triglyceride levels.

Collecte de sang pour analyse biochimique chez le poisson zèbre adulte

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolement du ribosome Bound polypeptides naissants<em&gt; In vitro</em&gt; Pour identifier les sites de pause de translation le long d&#39;ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Biochimique et High Throughput évaluation microscopique de la masse grasse dans<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

Le titrage à haut débit de la luciférase-virus recombinants exprimant

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Approches génétiques et biochimiques pour<em&gt; In Vivo</em&gt; et<em&gt; In vitro</em&gt; Évaluation de Protein oligomérisation: Étude de cas Ryanodine Receptor

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The fermentable carbon concentration mainly governs how the yeast cells generate ATP; thus, the variation in fermentable carbohydrate levels drives the energetic metabolism of S. cerevisiae. This paper describes a high-throughput method based on exponential yeast growth to estimate the effects of concentration changes and nature of the carbon source on respiratory and fermentative metabolism. The growth of S. cerevisiae is measured in a microplate or shaken conical flask by determining the optical density (OD) at 600 nm. Then, a growth curve is built by plotting OD versus time, which allows identification and selection of the exponential phase, and is fitted with the exponential growth equation to obtain kinetic parameters. Low specific growth rates with higher doubling times generally represent a respiratory growth. Conversely, higher specific growth rates with lower doubling times indicate fermentative growth. Threshold values of doubling time and specific growth rate are estimated using well-known respiratory or fermentative conditions, such as non-fermentable carbon sources or higher concentrations of fermentable sugars. This is obtained for each specific strain. Finally, the calculated kinetic parameters are compared with the threshold values to establish whether the yeast shows fermentative and/or respiratory growth. The advantage of this method is its relative simplicity for understanding the effects of a substance/compound on fermentative or respiratory metabolism. It is important to highlight that growth is an intricate and complex biological process; therefore, preliminary data from this method must be corroborated by the quantification of oxygen consumption and accumulation of fermentation byproducts. Thereby, this technique can be used as a preliminary screening of compounds/substances that may disturb or enhance fermentative or respiratory metabolism.

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Here we present a protocol to estimate the respiratory and fermentative metabolism by fitting the exponential growth of Saccharomyces cerevisiae to the exponential growth equation. Calculation of the kinetic parameters allows for the screening of influences of substances/compounds on fermentation or mitochondrial respiration.

Saccharomyces cerevisiae Cinétique de croissance exponentielle en Culture pour analyser le métabolisme respiratoire et fermentatif

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In vitro Analyse de la fonction E3 Ubiquitin Ligase

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...