Notre laboratoire étudie les changements métaboliques dans la rétine et dans tout le système nerveux central qui se produisent avec l’âge ainsi que dans les maladies neurodégénératives. Notre objectif primordial est de tirer parti de ces résultats pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter les maladies neurodégénératives liées à l’âge. La détection de l’absorption du glucose dans le tissu rétinien est souvent coûteuse et prend du temps, nécessitant des modalités d’imagerie compliquées ou même des substances radioactives.
Nous avons établi ce protocole pour fournir une nouvelle technique ex vivo pour mesurer l’absorption d’analogues du glucose fluorescents dans des échantillons rétiniens. Le protocole que nous avons mis au point fournit une stratégie simple et rentable pour mesurer l’absorption ex vivo des analogues du glucose fluorescents dans l’ensemble de la rétine intacte. Cette méthode est également avantageuse car elle permet aux chercheurs de mesurer plusieurs échantillons simultanément.
Ce protocole permettra aux chercheurs d’évaluer les changements dans l’absorption rétinienne des analogues fluorescents du glucose, ce qui nous aidera à mieux comprendre comment la rétine utilise le glucose comme substrat énergétique à la fois avec l’âge et dans les états sains et pathologiques. Pour commencer, préparez une solution mère de cinq millimolaires de 6-NBDG dans un mélange de 50 % de DMSO et de PBS. Conservez 500 aliquotes de microlitres de la solution à moins 20 degrés Celsius.
Placez un tube conique de 50 millilitres contenant du Neurobasal-A Medium sans glucose sur de la glace. Étiquetez les microtubes à centrifuger de 1,5 millilitre comme étant une carence en glucose, une incubation de 6-NBDG, une sonication et un prélèvement d’échantillons pour le test de perforation. Ajoutez 100 microlitres de Neurobasal-A Medium réfrigéré dans les tubes de sonication pré-étiquetés sur de la glace.
Mettez le lecteur de plaques sous tension. Configurez les paramètres de la plaque dans le logiciel du lecteur de plaques à l’aide de la fonction de test de fin de fluorescence avec une excitation réglée sur 483 nanomètres, une émission réglée sur 550 nanomètres et une coupure réglée sur 530 nanomètres. Diluez la solution mère de cinq millimolaires de six NBDG dans un milieu neurobasal-A pour préparer une solution de travail de 500 micromolaires et couvrez-la d’une feuille d’aluminium pour la protéger de la lumière.
Pipeter 200 microlitres de la solution de travail dans les tubes d’incubation 6-NBDG pré-étiquetés et le couvercle comme illustré. Après avoir isolé la rétine d’une souris euthanasiée à l’aide d’une pipette de transfert ou d’une pince à épiler, transférez la rétine dans un tube de 1,5 millilitre contenant 200 microlitres de milieu Neurobasal-A pour le manque de glucose. Incuber le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.
Transférez la rétine dans un tube pré-étiqueté contenant 200 microlitres de 6-NBDG de 500 micromolaires dans le milieu Neurobasal-A. Incuber le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes. Pour préparer des étalons 6-NBDG, étiquetez huit microtubes à centrifuger de 1,5 millilitre comme étalons un à huit.
Pour un tube standard, pipetez 32 microlitres de 500 micromolaires de solution mère de 6-NBDG dans le tube étiqueté. Ajoutez ensuite 368 microlitres de Neurobasal-A Medium dans le tube et mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas. Recouvrez tous les tubes de papier d’aluminium.
Après l’incubation de 60 minutes au 6-NBDG, retirer les tubes du bain-marie à 37 degrés Celsius. Pour laver la rétine, prélever la solution de 6-NBDG à l’aide d’une pipette sans perturber le tissu rétinien et ajouter 500 microlitres de glace fraîche froide Neurobasal-A Medium sur glace. Ensuite, à l’aide d’une pince, transférez soigneusement la rétine dans les tubes de sonication contenant du milieu neurobasal-A sur de la glace.
À l’aide de petits ciseaux de dissection, coupez la rétine en petits morceaux. Sonicez chaque rétine pendant cinq à 10 secondes à une amplitude de 10, et remettez immédiatement le tube sur de la glace. Centrifuger les échantillons à 21, 130 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.
Transvasez 100 microlitres de surnageant dans une plaque à 96 puits. Insérez la plaque dans le lecteur de plaques. Sélectionnez le test de fin de fluorescence avec les longueurs d’onde spécifiées.
Exécutez le test et enregistrez les résultats. Après l’essai, pipetez les échantillons de la plaque à 96 puits dans des tubes pré-étiquetés pour le test de perçage. À l’aide des étalons protéiques pré-dilués du test de perforation, ajoutez 10 microlitres de chaque étalon en double dans une plaque inférieure transparente à 96 puits.
Transférez ensuite 10 microlitres d’échantillon dans la plaque. Ajouter 150 microlitres de réactif de perçage dans tous les puits contenant des étalons ou des échantillons. Couvrez l’assiette et mélangez sur une plaque vibrante à vitesse moyenne pendant une minute.
Incuber la plaque à température ambiante pendant cinq minutes. Insérez la plaque dans le lecteur de plaques et sélectionnez le test d’absorbance avec une longueur d’onde réglée sur 660 nanomètres. Mesurez l’absorbance des étalons et des échantillons, enregistrez les résultats et tracez une courbe standard pour déterminer le microgramme total de protéines dans chaque échantillon.
Les mesures de fluorescence du glucose ont montré une augmentation de l’absorption de 6-NBDG dans la rétine de souris de type sauvage après 30 minutes d’incubation, culminant à 60 minutes, suivie d’une diminution des unités arbitraires après 90 minutes. L’ajout de l’inhibiteur de GLUT1, bay 876, a réduit l’absorption de 6-NBDG de 24 %, ce qui indique l’implication de mécanismes indépendants de GLUT1 dans la rétine de souris de type sauvage.
