Cette méthode est un outil pour étudier les mécanismes impliqués dans la libération de CGRP par le système vasculaire du trijumeau. Le principal avantage de cette méthode est la capacité de diviser le système vasculaire du trijumeau en trois sites différents et d’évaluer la libération du CGRP dans chaque site distinct. La procédure sera présentée par moi-même et Inger Jansen-Olesen, une scientifique principale de notre groupe.
Pour commencer, préparez le tissu de rat en enlevant la peau et le muscle autour de la tête et du cou à l’aide de ciseaux. Ensuite, utilisez une tondeuse à os et une paire de ciseaux pour séparer les mâchoires inférieures de la tête. Maintenant, exposez la moelle épinière et le tronc cérébral en insérant une tondeuse osseuse caudale dans la partie dorsale des vertèbres et retirez-la.
Ensuite, coupez la partie caudale du crâne par les bords des os occipital et interpariétal pour enlever ces structures osseuses, exposant le cervelet. Pour isoler le TNC qui coule caudalement à environ 13 à 16 millimètres du bregma de chaque côté, coupez la partie dorsolatérale du tronc cérébral avec des ciseaux à ressort. Vient ensuite l’immersion des TNC gauche et droit dans SIF.
Ensuite, coupez la tête à mi-saggitally pour diviser le crâne en deux à l’aide d’une scie. Maintenant, retirez soigneusement le cerveau sans toucher la dure-mère attachée au crâne à l’aide d’une spatule. Pour isoler le TG, coupez-le y compris ses branches autour des bordures visuelles avec la branche mandibulaire entrant dans le foramen ovale et les branches ophtalmiques et maxillaires entrant dans le crâne.
Ensuite, immergez les moitiés crâniennes et les TG dans SIF. Pour préparer le tissu de souris, retirez la peau et le muscle autour de la tête et du cou à l’aide de ciseaux. Maintenant, exposez la moelle épinière et le tronc cérébral en insérant une paire de ciseaux caudale dans la partie dorsale des vertèbres et retirez-la.
Coupez ensuite la partie caudale du crâne par les bords des os occipitaux et interpariétaux pour enlever ces structures osseuses exposant le cervelet. Coupez l’os pariétal au milieu de la paggite et retirez l’os pour exposer le cerveau. Retirez délicatement le cervelet pour exposer le tronc cérébral à l’aide d’une spatule.
Isoler le TNC contenant une partie du tronc cérébral avec des ciseaux à ressort, puis immerger le tronc cérébral dans le SIF. Maintenant, retirez soigneusement le cerveau à l’aide d’une spatule et coupez le nerf trijumeau où il pénètre dans le tronc cérébral. Pour isoler le TG, coupez-le y compris ses branches autour des bordures visuelles avec la branche mandibulaire où il pénètre dans le foramen ovale et les branches ophtalmiques et maxillaires entrant dans le crâne.
Ensuite, immergez les TG dans SIF. Pour faciliter l’échange de SIF, ajoutez un couvercle de péage aux contenants en plastique et commencez à laver le tissu de rat et de souris dans SIF pendant 30 minutes en remplaçant SIF toutes les cinq minutes. Après 30 minutes de lavage à température ambiante, transférer les moitiés TNC et les TG de rat dans des bouchons de tubes microcentrifugés séparés contenant 350 microlitres de SIF.
Transférer le tronc cérébral de la souris avec TNC dans un bouchon de tube microcentrifuge contenant 250 microlitres de SIF. Enfin, transférez les deux TG de souris dans un bouchon de tube microcentrifuge contenant 250 microlitres de SIF. Placez les moitiés du crâne de rat sur une plaque de culture à six puits et remplissez le crâne avec 400 microlitres de SIF.
Placez les crânes de rats dans des capsules de tubes microcentrifugeuses avec du tissu de rat et de souris dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius. Remplacez SIF à l’aide d’une pipette toutes les cinq minutes pendant 20 minutes sans toucher le mouchoir. Préparer les tubes microcentrifugés pour le prélèvement des échantillons par étiquetage approprié.
Ajoutez ensuite 50 microlitres de tampon EIA à 10 concentrations dans chaque tube de microcentrifugeuse. Ensuite, préparer la solution du composé d’essai et la solution du véhicule en diluant dans le SIF pour toutes les concentrations. Après le dernier lavage, ajoutez 250 microlitres de SIF à la souris TG et TNC, 350 microlitres SIF à la TG et au TNC du rat et 400 microlitres au SIF à chaque crâne de rat.
Après 10 minutes d’incubation, prélever 200 microlitres de l’échantillon dans un tube microcentrifuge pré-marqué avec 50 microlitres de tampon EIA de 10 concentrations pour permettre la mesure de la libération basale de CGRP. Jetez le liquide restant et conservez immédiatement les échantillons à moins 20 degrés Celsius. Ajouter le composé d’essai dans le véhicule correspondant à des concentrations croissantes, en commençant par la concentration la plus faible, et incuber pendant 10 minutes.
Après 10 minutes d’incubation, prélever 200 microlitres de l’échantillon dans un tube microcentrifuge pré-marqué avec 50 microlitres de tampon EIA de 10 concentrations. Jetez le liquide restant et ajoutez la deuxième concentration la plus faible au tissu. Conservez immédiatement les échantillons à moins 20 degrés Celsius et répétez cette procédure avec la concentration restante.
Pour effectuer un contrôle positif pour l’expérience, ajoutez le contrôle positif au tissu à la fin du protocole. Après une période d’incubation de 10 minutes, prélever un échantillon de 200 microlitres dans un tube à microcentrifugation avec 50 microlitres de tampon EIA de 10 concentrations. Les concentrations de CGRP rejetées dans les échantillons prélevés sont mesurées à l’aide d’une trousse d’EIA tout en suivant les instructions du fabricant fournies avec la trousse d’EIE.
Chez le rat, l’exposition à la capsaïcine a induit une libération importante de CGRP de la dure-mère et de la TG par rapport au véhicule. Dans la dure-mère, la libération maximale de CGRP a été trouvée à une micromolaire de capsaïcine. Et dans TG, la libération maximale de CGRP a été trouvée à 10 micromolaires de capsaïcine.
Lorsqu’il est analysé avec une ANOVA unidirectionnelle, le glibenclamide ne montre aucun effet sur la libération basale de CGRP de la dure-mère et de la TG. Le glibenclamide a significativement réduit la libération de CGRP induite par la capsaïcine dans la dure-mère de 40% et la TG de 39% par rapport à la capsaïcine avec le véhicule lorsqu’elle est analysée avec une ANOVA unidirectionnelle. Le super cinnamaldéhyde agoniste antyrine-1 du récepteur transitoire libérant du CGRP d’une manière dépendante de la concentration du TG avec 1, 10 et 100 micromolaires de super cinnamaldéhyde, ce qui entraîne une augmentation de 9% de la libération de CGRP de 9% et 69% par rapport au véhicule respectivement lorsqu’il est analysé avec une ANOVA bidirectionnelle. La libération accrue de CGRP était absente dans la TG des souris knockout potentielles du récepteur transitoire Ankyrin-1 où l’exposition à 1, 10 et 100 micromolaires de super cinnamaldéhyde entraînant une variation de 11% moins 13% et 9% de la libération de CGRP par rapport au véhicule respectivement lorsqu’elle était analysée avec une ANOVA bidirectionnelle.
Il est important de veiller à ne pas toucher le tissu pendant le prélèvement de l’échantillon et d’être précis lors du moment de l’incubation de tous les échantillons. Si des kits ELISA adéquats sont disponibles, il est possible d’appliquer cette procédure pour mesurer la libération d’autres peptides présents dans le système vasculaire du trijumeau.
