Trouver des traitements pour le glioblastome est difficile en raison de la diversité cellulaire qui existe dans les tumeurs et des interactions entre divers microenvironnements. Les organoïdes peuvent aider à recréer une partie de cette diversité spatiale, et nous pouvons l’utiliser pour mieux comprendre la biologie des tumeurs. Alors que les méthodes traditionnelles de culture cellulaire ont tendance à produire des populations homogènes de cellules tumorales, les organoïdes peuvent mieux imiter la diversité moléculaire et cellulaire du glioblastome et mieux modéliser les interactions intratumorales.
Les organoïdes peuvent être utilisés pour étudier l’efficacité des médicaments et les mécanismes de résistance. La résistance aux thérapies cliniques ne peut apparaître que dans les organoïdes et non dans la culture de sphère traditionnelle, reflétant la réalité clinique de cette maladie. Les organoïdes peuvent aider à démontrer les effets régionaux des chimiothérapies.
Ils peuvent être utilisés pour découvrir de nouvelles thérapies spécifiques à un créneau, et ils peuvent également servir d’outil prédictif pour la médecine personnalisée à l’avenir. Certains matériaux utilisés pour créer des organoïdes sont sensibles à la température, et négliger de garder ces matériaux à leur température appropriée peut entraîner des difficultés à créer ou à maintenir des organoïdes. Commencez à préparer les moules organoïdes sous une hotte de culture en retirant le papier ciré de la feuille de parafilm et en le plaçant entre deux plaques stériles de réaction en chaîne par polymérase à 96 puits ou plaques de PCR.
Assurez-vous que l’intérieur du parafilm est propre. Appliquez une pression uniforme sur la plaque supérieure pour former de petites fossettes de deux millimètres de profondeur dans le parafilm sans créer de trous. Séparez les plaques.
Le parafilm alvéolé collera à la plaque supérieure. Placez ensuite la plaque supérieure sur de la glace sèche pendant 30 secondes. Utilisez des pinces stériles pour retirer le parafilm de la plaque supérieure en un mouvement rapide.
Le parafilm congelé est plus facile à enlever. Placez le moule de parafilm terminé dans une boîte de culture cellulaire stérile couverte de 10 centimètres. Pour préparer la suspension unicellulaire de culture adhérente au glioblastome ou au GBM, retirez le milieu utilisé de la plaque.
Ajoutez ensuite deux millilitres de solution de détachement de cellules à température ambiante dans la plaque et incuber la plaque à 37 degrés pendant trois minutes. Après avoir confirmé le détachement cellulaire de la plaque au microscope, ajouter huit millilitres de milieu neurobasal complet, ou milieu NBMc, pour neutraliser la solution de décollement cellulaire. Filtrer la suspension à travers une seule crépine cellulaire de 70 microns.
Faites tourner les cellules à 120 fois G pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de NBMc. Comptez les cellules de la suspension unicellulaire à l’aide d’une coloration imperméable à la cellule.
Pour fabriquer des organoïdes à partir d’une suspension unicellulaire, ajoutez une quantité appropriée de matrice extracellulaire riche en laminine, ou lrECM, dans un petit tube centrifuge dans un seau à glace ou un bloc froid. Préparer un mélange cellulaire contenant 20 000 cellules par organoïde. Bien mélanger le mélange de suspension cellulaire lrECM pour éviter de tassement des cellules, ce qui entraînerait une formation organoïde non uniforme.
Ensuite, pipeter soigneusement 20 microlitres du mélange sur un moule de parafilm pour former une gouttelette en forme de perle. Assurez-vous de refroidir l’embout de la pipette tous les deux ou trois organoïdes pour empêcher la polymérisation lrECM. Une fois que le nombre souhaité d’organoïdes est pipeté sur le moule du parafilm dans une plaque de culture de 10 centimètres, incuber les organoïdes à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures dans un incubateur de culture cellulaire.
Une fois les organoïdes solidifiés, rincer doucement les organoïdes du moule du parafilm avec un milieu NBMc à l’aide d’une pointe P1000 et les rassembler dans une nouvelle plaque de culture de 10 centimètres contenant 20 millilitres de NBMc. Placez la plaque de culture dans un incubateur sans la secouer pendant quatre jours. Après quatre jours, remplacez le support dans la plaque.
Pour ce faire, placez un morceau de papier foncé sous la plaque de culture cellulaire. Inclinez la plaque et attendez 20 secondes. Lorsque les organoïdes se déposent complètement au fond du plat, retirez lentement le média avec une pipette en verre à grande ouverture.
Après avoir ajouté de nouveaux médias, placez la plaque dans l’incubateur sur un agitateur orbital à 80 tr / min et échangez ensuite les milieux tous les deux ou trois jours. La croissance de l’organoïde a été observée par microscopie optique. Dans la vue centrale, la croissance organoïde précoce a montré la migration et l’invasion unicellulaire par lrECM.
Les organoïdes matures à sept semaines étaient de la taille d’un centime. La coloration immunohistochimique des organoïdes GBM avec phospho-histone H3 a révélé des cellules hautement prolifératives avec un aspect brun ou violet dans le périmètre organoïde par rapport au noyau. Les données sur la viabilité cellulaire des organoïdes dans le DMSO à 0,1 % ont démontré une cohérence intraorganoïde et interorganoïde.
Faites attention à la biomasse organoïde et à l’acidification des milieux. Si les organoïdes traversent le milieu trop rapidement, assurez-vous de les échanger plus fréquemment ou de les diviser entre des plaques supplémentaires. Les organoïdes matures peuvent être utilisés pour des expériences avec des thérapies ou intégrés et sectionnés pour une utilisation avec l’immunohistochimie ou l’immunofluorescence.
Les organoïdes dissociés peuvent être utilisés pour l’analyse FACS. Ces organoïdes ont récemment été utilisés dans le criblage fonctionnel tridimensionnel pour découvrir des cibles essentielles dans des niches de cellules souches cancéreuses spatialement distinctes. Nous utilisons également ces modèles pour prioriser différents médicaments et thérapies avant les tests in vivo.
