Cette étude a été financée par les National Institutes of Health (R03NS131908) et le ministère de la Défense par le biais du programme de recherche sur la sclérose en plaques sous le numéro de bourse W81XWH-22-1-0517. Les opinions, interprétations, conclusions et recommandations sont celles de l’auteur et ne sont pas nécessairement approuvées par le ministère de la Défense. Cette étude a également été soutenue par des fonds de démarrage de l’Université de Caroline de l’Est.

Toutes les procédures impliquant des souris ont été effectuées conformément aux directives expérimentales approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Caroline de l’Est (IACUC). Des souris femelles Wildtype C57BL/6J âgées de 8 à 10 semaines ont été utilisées dans cette étude. Les animaux proviennent d’une source commerciale (voir la Table des matières). L’EAE a été induite à la suite de rapports précédemment publiés 12,13,14.
1. Collection de sérum
<ol><li>Euthanasier la souris expérimentale par asphyxie au CO2 ou surdose d’isoflurane au moment requis (selon les protocoles approuvés par l’établissement) après avoir induit l’EAE par l’immunisation MOG35-55. REMARQUE : Le nombre total de souris et les points temporels pour la collecte du sérum peuvent varier en fonction de l’expérience spécifique.</li>
	<li>Une fois que l’absence de signes vitaux est confirmée par un pincement des orteils ou de la queue, placez la souris en position de décubitus dorsal sur un plateau de dissection et fixez les membres en position avec des épingles ou du ruban adhésif. Orientez le corps de la souris sur la source lumineuse LED (voir tableau des matériaux) pour éclairer le thorax de l’animal.</li>
	<li>Vaporisez la fourrure de souris avec de l’éthanol à 70 % et faites une incision médiane de 3 à 4 cm le long de l’abdomen, du bassin au xiphoïde, à l’aide des ciseaux de dissecteur, en prenant soin d’éviter les organes et les principaux vaisseaux (Figure 1A-C). Pour faciliter la procédure, utilisez la pince pour saisir la peau au-dessus du processus xiphoïde.</li>
	<li>Coupez le diaphragme latéralement, puis coupez la cage thoracique vers l’avant sur les deux bords latéraux à l’aide des ciseaux à ressort, en vous arrêtant avant d’atteindre le sternum sur la ligne médiane (Figure 1D). Repliez le rabat de nervure créé sur la tête de la souris pour exposer le cœur (Figure 1E). REMARQUE : Il est à éviter de couper le sternum car cela endommagerait les principales artères thoraciques adjacentes à l’os et réduirait le volume de sang pouvant être collecté.</li>
	<li>Insérez une aiguille de 25 g reliée à une seringue de 1 mL dans le ventricule gauche et prélevez le sang en tirant doucement le piston vers l’arrière (figure 1F). Pour faciliter la ponction de l’aiguille, calez doucement le cœur contre une paire de pinces. REMARQUE : Si le sang n’apparaît pas immédiatement dans la seringue, l’aiguille doit être tournée lentement et un angle différent doit être testé. Cependant, des efforts doivent être faits pour placer correctement l’aiguille dès la première tentative afin d’éviter de créer des trous inutiles dans le cœur où le sang peut s’échapper.</li>
	<li>Transférez le sang dans un tube stérile de 1,5 ml et laissez-le coaguler pendant 30 minutes à température ambiante. Retirer le caillot par centrifugation à 2000 × g pendant 20 min à 4 °C. Prélever le surnageant, qui représente la fraction sérique, et stocker les aliquotes à usage unique dans des tubes cryogéniques à -80 °C pour des tests futurs.</li>
</ol>2. Dosage ELISA
<ol><li>Remettre en suspension le peptide MOG35-55 lyophilisé (voir tableau des matières) dans l’eau pour obtenir un stock de 10 mg/mL. Avant de commencer l’expérience, diluer la substance à 10 μg/mL dans un tampon de revêtement (voir le tableau des matériaux) et pipeter 100 μL/puits de la solution finale dans une plaque à 96 puits. Scellez la plaque avec un film adhésif pour éviter l’évaporation et incubez la plaque pendant la nuit à 4 °C. REMARQUE : Au moins 2 puits doivent être calculés pour chaque échantillon et 2 puits supplémentaires doivent également être inclus pour un contrôle à blanc.</li>
	<li>En parallèle, enduire le même nombre de puits avec 100 μL/puits d’albumine sérique bovine (BSA) dissoute dans un tampon d’enrobage à une concentration de 10 μg/mL. Ces puits supplémentaires serviront de contrôles en arrière-plan. REMARQUE : Il est recommandé d’enduire avec BSA les puits de contrôle car les tampons de revêtement et de blocage ont des compositions différentes. Veuillez noter que d’autres peptides encéphalitogènes (tels que PLP139-151 ou MBP84-104) pourraient être utilisés comme antigènes non pertinents en alternative à la BSA.</li>
	<li>Le lendemain, laver la plaque 3 fois avec 200 μL/puits de solution saline tampon phosphatée complétée par 0,05 % de Tween 20 (PBS-T). Par la suite, ajouter 100 μL/puits d’une solution bloquante composée de 3 % de BSA dans du PBS (sans Tween 20) et incuber la plaque scellée pendant 1 h à 37 °C dans un four d’hybridation.</li>
	<li>Lavez la plaque 3 fois avec 200 μL/puits de PBS-T. Diluer chaque échantillon de sérum à 1:100 dans une solution bloquante et ajouter 100 μL/puits dans les puits revêtus de MOG35-55 et de BSA. Ajouter le même volume de solution de blocage dans les puits désignés comme blancs. Incuber la plaque scellée pendant 2 h à température ambiante, en agitant constamment (250 tr/min).</li>
	<li>Lavez la plaque 3 fois avec 200 μL/puits de PBS-T. Diluer l’anticorps secondaire conjugué à la HRP (1:2000, voir le tableau des matériaux) dans une solution composée de 0,2 % de BSA dans du PBS-T et ajouter 100 μL/puits à tous les puits. Incuber la plaque scellée pendant 1 h à température ambiante, en agitant constamment (250 tr/min).</li>
	<li>Lavez la plaque 3 fois avec 200 μL/puits de PBS-T. Ajouter 100 μL/puits de substrat de tétraméthylbenzidine (TMB) 3,3',5,5' (voir le tableau des matériaux) à tous les puits et incuber dans l’obscurité pendant 1 à 5 min, en surveillant le développement d’une couleur bleue.<ol><li>Arrêtez la réaction en ajoutant 100 μL/puits de solution d’arrêt (voir le tableau des matériaux) et mesurez la densité optique (DO) dans chaque puits à l’aide d’un lecteur de plaques réglé à une longueur d’onde de 450 nm. REMARQUE : Le substrat TMB doit être équilibré à température ambiante pendant 30 à 60 minutes avant de l’ajouter dans les puits.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analyse des données
<ol><li>Remplissez une feuille de calcul Excel avec les valeurs OD lues à partir de la plaque. Faites la moyenne des valeurs de DO obtenues à partir de puits dupliqués (MOG35-55 et revêtus de BSA) pour chaque échantillon.</li>
	<li>Pour chaque échantillon, soustraire la valeur moyenne des puits revêtus de BSA de celle des puits revêtus de MOG35-55. Les valeurs corrigées du bruit de fond qui en résultent seront proportionnelles à la concentration d’anticorps anti-MOG35-55 dans les différents échantillons de sérum. REMARQUE : Les puits vides doivent donner des valeurs corrigées autour de 0.</li>
	<li>Appliquez un test statistique non paramétrique tel que le test U de Mann-Whitney pour comparer les valeurs moyennes de DO entre deux conditions expérimentales. Incluez au moins 3 échantillons indépendants pour chaque condition.</li>
</ol>

Étude de la réponse humorale dans la démyélinisation auto-immune

<ol>
	<li>Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis.">Multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).</li><li>Baranzini, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+repertoire+diversity+and+clonal+expansion+in+multiple+sclerosis+brain+lesions.">B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions.</a> J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).</li><li>Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+autoantibodies+associated+with+myelin+damage+in+multiple+sclerosis.">Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis.</a> Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).</li><li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+hypomethylation+programs+underpin+b+cell+activation+in+early+multiple+sclerosis.">Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118 (2021).</li><li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocrelizumab+versus+interferon+beta-1a+in+relapsing+multiple+sclerosis.">Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).</li><li>Montalban, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocrelizumab+versus+placebo+in+primary+progressive+multiple+sclerosis.">Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).</li><li>Didonna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+multiple+sclerosis:+Advantages+and+limitations+towards+better+therapies.">Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies.</a> Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).</li><li>Steinman, L., Zamvil, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+successfully+apply+animal+studies+in+experimental+allergic+encephalomyelitis+to+research+on+multiple+sclerosis.">How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis.</a> Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).</li><li>Khare, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein-specific+antibodies+from+multiple+sclerosis+patients+exacerbate+disease+in+a+humanized+mouse+model.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model.</a> J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).</li><li>Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+antibodies+recognize+glycosylated+epitopes+and+perturb+oligodendrocyte+physiology.">Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).</li><li>Flach, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody-boosted+t-cell+reactivation+in+the+target+organ+triggers+manifestation+of+autoimmune+cns+disease.">Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).</li><li>Didonna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-1+regulates+b+cell+function+and+the+severity+of+autoimmune+experimental+encephalomyelitis.">Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).</li><li>Didonna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-specific+tau+methylation+patterns+and+synaptic+transcriptional+alterations+are+associated+with+neural+vulnerability+during+chronic+neuroinflammation.">Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation.</a> J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).</li><li>Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte-specific+argonaute+profiling+identifies+micrornas+associated+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 297 (2020).</li><li>Lanz, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonally+expanded+b+cells+in+multiple+sclerosis+bind+ebv+ebna1+and+glialcam.">Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam.</a> Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).</li></ol>

Les auteurs ne déclarent pas d’intérêts concurrents.

Ici, un protocole simple et efficace basé sur l’ELISA a été rapporté pour quantifier avec précision la réponse humorale dans un modèle animal pertinent de la pathologie de la SEP. Cette méthode a récemment été utilisée pour décrire le nouveau rôle de la protéine ataxine-1 dans le contrôle des taux sériques d’auto-anticorps dans le paradigme MOG35-55/C57BL6J EAE12. À cet égard, un certain nombre de facteurs doivent être pris en considération afin d’obtenir des résultats ...

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune chronique du système nerveux central (SNC) caractérisée par une infiltration focale de cellules immunitaires dans le parenchyme cérébral, une dégradation des gaines de myéline enveloppant les axones, une activation de la glie et une perte neuronale1. En plus du rôle bien établi des lymphocytes T pathogènes, de multiples éléments de preuve ont mis en évidence l’implication des lymphocytes B dans la médiation de la réponse auto-immune contre le SNC. Les lymphocytes B subissent une expansion clonale dans le cerveau de la SP et des anticorps dirigés contre les composants de la myéline ont été détectés dans les lésions démyélinisées 2,3. L’activation sélective des lymphocytes B périphériques au début de la maladie a été récemment documentée, suggérant un rôle présumé de ce compartiment cellulaire immunitaire dans l’initiation de la maladie4. Le succès des thérapies d’appauvrissement des lymphocytes B, telles que les anticorps monoclonaux anti-CD20, corrobore davantage le lien mécaniste entre le fonctionnement aberrant des lymphocytes B et la démyélinisation auto-immune 5,6. D’un point de vue moléculaire, les lymphocytes B peuvent contribuer à la maladie via la présentation d’auto-antigènes, la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et la production d’anticorps autoréactifs.
De multiples modèles animaux ont été mis au point pour récapituler les caractéristiques spécifiques du phénotype complexe de la SP. Parmi eux, l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le paradigme in vivo le plus largement utilisé et repose sur l’immunisation d’animaux de laboratoire avec des peptides courts dérivés de protéines de myéline telles que la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG) et la protéine basique de la myéline (MBP)7. Les animaux immunisés contre l’EAE développent une pathologie démyélinisante qui ressemble à la SEP à bien des égards, y compris une réponse humorale robuste contre le peptide encéphalitogène8. Pour cette raison, les études EAE ont joué un rôle déterminant dans la dissection de la fonction des lymphocytes B et des auto-anticorps dans le contexte de la maladie. Par exemple, il a été démontré que les anticorps spécifiques de MOG isolés chez des patients atteints de SEP peuvent aggraver l’évolution clinique dans les modèles EAE9. Notamment, le résidu de proline à la position 42 dans le MOG humain s’est avéré essentiel pour déterminer la pathogénicité des auto-anticorps10. Plus récemment, il a été constaté que les auto-anticorps spécifiques de MOG favorisent la maladie non seulement en médiant la perte de myéline, mais aussi en stimulant la réactivation des lymphocytes T autoréactifs dans le SNC11.
Compte tenu de l’importance des réponses anticorps dans l’auto-immunité du SNC, cet article présente un protocole basé sur ELISA pour mesurer efficacement les taux sériques d’anticorps autoréactifs chez les souris C57BL/6J EAE immunisées avec le peptide MOG35-55. Dans la première partie du protocole, la méthode de prélèvement du sérum par ponction intracardiaque sera décrite. Par la suite, les procédures de mise en place du test ELISA et d’acquisition des données seront détaillées. Enfin, l’analyse et l’interprétation des données seront abordées.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5,5&#39;-tetramethylbenzidine (TMB) substrate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N301</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive seals</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AB0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J female mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-500-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S111022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissector scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14082-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA coating buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>421701</td>
			<td>Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Analysis spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>1030-05</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light source</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AMPSILED21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-377-575&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-000-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse MOG35-55 peptide</td>
			<td>EZBiolab</td>
			<td>cp7203</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AP-12-200-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noyes spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15011-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp 96-well plates</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88-861-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>445-0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated tabletop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of autoreactive antibodies in mice upon experimental autoimmune encephalomyelitis

L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle de maladie qui récapitule la maladie auto-immune de la sclérose en plaques (SEP) aux niveaux histopathologique et moléculaire. L’EAE est induite par l’immunisation d’animaux de laboratoire par injection sous-cutanée de peptides de myéline courts associés à des adjuvants spécifiques pour stimuler la réponse immunitaire. Comme leurs homologues humains, les souris EAE développent des lésions démyélinisantes, une infiltration de cellules immunitaires dans le système nerveux central (SNC), une activation gliale et des lésions neuronales. De nombreuses données probantes confirment également l’existence d’un rôle mécaniste du dysfonctionnement des lymphocytes B dans l’étiologie de la SP et de l’EAE. Les lymphocytes B peuvent servir de cellules présentatrices d’antigènes ainsi que de source primaire de cytokines pro-inflammatoires et d’auto-anticorps. Dans l’EAE, des anticorps sont générés contre les peptides de myéline qui ont été utilisés pour induire la maladie. Il a été démontré que ces auto-anticorps médient soit la perte de myéline, soit la réactivation des lymphocytes T pathogènes dans le SNC. Cet article décrit un protocole efficace basé sur l’ELISA pour quantifier les auto-anticorps dans le sérum de souris C57BL/6J immunisées avec le peptide de la glycoprotéine 35-55 de la myéline oligodendrocyte (MOG35-55). La méthode proposée constitue un outil puissant pour étudier la spécificité et l’ampleur de la réponse humorale aberrante dans le contexte de la démyélinisation auto-immune.

Multiple sclerosis (MS) is a chronic autoimmune disease of the central nervous system (CNS) characterized by focal infiltration of immune cells into the brain parenchyma, breakdown of myelin sheaths wrapping axons, glia activation, and neuronal loss1. In addition to the well-established role of pathogenic T cells, multiple lines of evidence have highlighted the involvement of B cells in mediating the autoimmune response against the CNS. B cells undergo clonal expansion in the MS brain and antibodies against myelin components have been detected within demyelinated lesions2,3. The selective activation of peripheral B cells at disease onset has been recently documented, suggesting a putative role for this immune cell compartment in disease initiation as well4. The success of B cell-depleting therapies such as anti-CD20 monoclonal antibodies further corroborates the mechanistic connection between aberrant B cell functioning and autoimmune demyelination5,6. From a molecular standpoint, B cells can contribute to disease via autoantigen presentation, pro-inflammatory cytokine secretion, and autoreactive antibody production.
Multiple animal models have been developed to recapitulate specific features of the complex MS phenotype. Among them, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most widely used in vivo paradigm and relies on the immunization of experimental animals with short peptides derived from myelin proteins such as myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) and myelin basic protein (MBP)7. EAE immunized animals develop a demyelinating pathology that resembles MS in many aspects, including a robust humoral response against the encephalitogenic peptide8. For this reason, EAE studies have been instrumental in dissecting the function of B cells and autoantibodies in the context of disease. For instance, it was demonstrated that MOG-specific antibodies isolated from MS patients can aggravate the clinical course in EAE models9. Notably, the proline residue at position 42 in human MOG was shown to be critical for determining autoantibody pathogenicity10. More recently, MOG-specific autoantibodies have been found to promote disease not only by mediating myelin loss but also via boosting the reactivation of autoreactive T cells within the CNS11. 
Considering the importance of antibody responses in CNS autoimmunity, this article presents an ELISA-based protocol to efficiently measure the serum levels of autoreactive antibodies in C57BL/6J mice EAE immunized with MOG35-55 peptide. In the first part of the protocol, the method to collect serum via intracardiac puncture will be described. Subsequently, the procedures to set up the ELISA assay and acquire the data will be detailed. Lastly, data analysis and interpretation will be discussed.

Pleins feux sur l’auteur : Un nouveau test pour étudier les réponses des lymphocytes B dans la recherche sur la sclérose en plaques

Quantification des anticorps autoréactifs chez la souris lors d’une encéphalomyélite auto-immune expérimentale

So the focus of our laboratory is to understand the molecular basis of multiple sclerosis, a immune disease of the central nervous system that is characterized by demyelination, neuroinflammation, and axonal injury. So this protocol represent an economical and flexible alternatives to commercial kits. Our can be easily adjusted to test B-cell antibody responses against different EEA peptides.My lab is devoted to further understanding the connection between neuroinflammation and neurodegeneration in chronic neurological diseases such as multiple sclerosis.

Pour démontrer la robustesse du test ELISA actuel, la méthode a été testée sur des échantillons de sérum isolés d’une cohorte de souris femelles C57BL/6J à 20 jours après l’immunisation (dpi) avec 100 μg de peptide MOG35-55 dans l’adjuvant de Freund complet (CFA) selon un protocole d’induction EAE validé 12,13,14. Les animaux ont également reçu 400 ng de toxine coqueluche les jours 0 et 2. Des échantillons...

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L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle animal de la sclérose en plaques (SEP), qui partage avec la maladie humaine une réponse auto-immune humorale robuste. Ici, nous rapportons un protocole ELISA simple et flexible pour quantifier les auto-anticorps dans le sérum de souris immunisées contre l’EAE.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a disease model that recapitulates the autoimmune disorder multiple sclerosis (MS) at histopathological ...

L’objectif de notre laboratoire est donc de comprendre la base moléculaire de la sclérose en plaques, une maladie immunitaire du système nerveux central caractérisée par une démyélinisation, une neuroinflammation et une lésion axonale. Ce protocole représente donc une alternative économique et flexible aux kits commerciaux. Notre peut être facilement ajusté pour tester les réponses des anticorps des lymphocytes B contre différents peptides EEA.Mon laboratoire se consacre à mieux comprendre le lien entre la neuroinflammation et la neurodégénérescence dans les maladies neurologiques chroniques telles que la sclérose en plaques.

quantification-autoreactive-antibodies-mice-upon-experimental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice upon Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

499 vues.  East Carolina University. L’objectif de notre laboratoire est donc de comprendre la base moléculaire de la sclérose en plaques, une maladie immunitaire du système nerveux central caractérisée par une démyélinisation, une neuroinflammation et une lésion axonale. Ce protocole représente donc une alternative économique et flexible aux kits commerciaux. Notre peut être facilement ajusté pour tester les réponses des anticorps des lymphocytes B contre différents peptides EEA.Mon laboratoire se consacr...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Un nouveau test pour étudier les réponses des lymphocytes B dans la recherche sur la sclérose en plaques

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a disease model that recapitulates the autoimmune disorder multiple sclerosis (MS) at histopathological and molecular levels. EAE is induced by immunizing experimental animals via subcutaneous injection of short myelin peptides together with specific adjuvants to boost the immune response. Like the human counterpart, EAE mice develop demyelinating lesions, immune cell infiltration into the central nervous system (CNS), glia activation and neuronal injury. A consistent body of evidence also supports a mechanistic role for B cell dysfunction in the etiology of both MS and EAE. B cells can serve as antigen-presenting cells as well as a primary source of pro-inflammatory cytokines and autoantibodies. In EAE, antibodies are generated against the myelin peptides that were employed to induce the disease. Such autoantibodies have been shown to mediate either myelin loss or pathogenic T cell reactivation into the CNS. This article describes an efficient ELISA-based protocol to quantify autoantibodies in the serum of C57BL/6J mice immunized with the myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 (MOG35-55) peptide. The proposed method serves as a powerful tool to investigate the specificity and magnitude of the aberrant humoral response in the context of autoimmune demyelination.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an animal model of multiple sclerosis (MS), which shares with the human disease a robust humoral autoimmune response. Here, we report a simple and flexible ELISA protocol to quantify autoantibodies in the serum of EAE immunized mice.

Recherche

Immunologie et infection

Serum Collection via Intracardiac Puncture in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Immunized Mice

Prélèvement de sérum par ponction intracardiaque chez des souris immunisées expérimentales contre l’encéphalomyélite auto-immune (EAE)

Quantification of Autoantibodies in the Serum of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Immunized Mice Using ELISA

Begin by re-suspending the lyophilized MOG 35 55 peptide in water. Dilute the peptide stock to 10 micrograms per milliliter in coating buffer before the experiment. Now pipette 100 microliters of the final solution into wells of a 96 well plate.Simultaneously coat an equal number of wells with 100 microliters of BSA dissolved in coating buffer. Seal the plate with an adhesive film to prevent evaporation and incubate the plate overnight at four degrees Celsius. The next day, perform three washes of the plate with 200 microliters of PBS supplemented with 0.5%tween 20.Subsequently add 100 microliters per well of a blocking solution composed of 3%BSA in PBS. Incubate the sealed plate for one hour at 37 degrees Celsius in a hybridization oven. After incubation, wash the plate three times with 200 microliters per well of PBST.Dilute each serum sample obtained from the blood of EAE immunized mice in blocking solution and add 100 microliters per well to both MOG 35 55 and BSA coated wells. Add the same volume of blocking solution to designated blank wells. Incubate the sealed plate for two hours at room temperature with constant shaking.After incubation, remove the plate from the incubator and rinse the plate three times with 200 microliters per well of PBST. Dilute the HRP conjugated secondary antibody in a solution consisting of 0.2%BSA in PBST and add 100 microliters to each well. Incubate the sealed plate for one hour at room temperature maintaining constant shaking.Wash the plate three times with 200 microliters per well of PBST. Add 100 microliters of three, three prime, five, five prime tetramethyl benzidine substrate to each well. Incubate in the dark for one to five minutes monitoring the development of a blue color.Add 100 microliters of stop solution to each well. Then use a plate reader set at a wavelength of 450 nanometers to measure the optical density in each well. The optical density values of the EAE samples were significantly higher than the control samples indicating a robust immunoglobulin G response against the MOG peptide.