Les anticorps monoclonaux sont connus sous le nom d’anticorps mono-spécifiques qui sont produits à partir d’un seul clone de lymphocyte B et des anticorps monovalents qui se lient à la même épitope. Récemment, l’ELISA monocoque à base d’anticorps est devenue notre plate-forme émergente pour l’analyse qualitative ou quantitative des aliments ou des produits naturels. Cette méthode est une méthode précise, sensible et efficace sans étapes fastidieuses de prétraitement.
C’est donc l’essentiel pour les échantillons biologiques et les futures applications cliniques. La préparation des MABs de TCM est une étape essentielle dans les études sur les caractéristiques complexes du système de la formule TCM. Nous avons développé un protocole pour générer des mWB contre les petits composés moléculaires, y compris la synthèse artificielle d’antigène, la vaccination de souris, et la fusion cellulaire.
L’hapten est relié à la protéine porteuse pour synthétiser l’antigène artificiel. Les antigènes artificiels et les adjuvants complets sont mélangés et émulsifiés. La souris a été vaccinée par injection sous-cutanée.
Sortez la rate de la souris immunisée et faites une suspension unicellule. Mélanger les cellules du myélome. Les splenocytes sont isolés et fusionnés avec la lignée cellulaire de myélome de souris HAT-sensible par la méthode PEG.
Sélectionnez une lignée cellulaire capable de préparer des anticorps par ELISA. Hybridomas sécrétant des anticorps monoclonaux qui sont réactifs à l’antigène sont clonés. Établir la lignée cellulaire hybridoma est cryopréservée.
La procédure périodique d’oxydation a été employée pour la synthèse d’un conjugué de BSA de narigin. Tout d’abord, le narigin a été dissous à une concentration finale d’un milligramme par millilitre à 100 microlitres de solution de pariodate de sodium fraîchement préparée à cinq millilitres de la solution narigin. Remuer le mélange à température ambiante pendant une heure.
Deuxièmement, ajouter deux millilitres de protéines porteuse au mélange de réaction par période de sodium narigin. Réglez le mélange à la solution pH neuf et continuez à réagir pendant six à huit heures. Troisièmement, l’antigène artificiel a été purifié avec la méthode de dialyse dans PDS pendant trois jours pour éloigner le CBS.
L’adjuvant complet et l’adjuvant incomplet de Freund ont été utilisés pour la vaccination des souris. Pour la vaccination, mélanger 50 microgrammes de conjugué avec un volume égal de l’adjuvant complet de Freund et émulsionner complètement. Administrer 100 microgrammes de ce mélange à chaque souris BALB/c par injection sous-cutanée dorsale.
Livrer une vaccination de rappel par injection sous-cutanée deux semaines plus tard avec la même quantité de conjugué mélangé avec adjuvant incomplet. Pour la vaccination primaire, l’adjuvant et l’immunogène complets de Freund ont été utilisés par injection subdermique. Pour la vaccination de rappel, l’adjuvant incomplet de Freund et l’immunogène ont été utilisés par injection subdermique.
Pour la vaccination à impact sans adjuvant, seul l’immunogène a été utilisé par injection subdermique ou injection intraperineal. Les cellules de couche d’alimentation provenaient principalement de cellules épithéliales abdominales ou de macrophages. RPMI 1640 FBS et HAT ont été utilisés pour préparer le support d’écran HAT.
Supplément HAT a été dissous en 10 millilitres RPMI moyen, puis ajouté en 500 millilitres RPMI 1640 contenant 20%FBS. Et la souris ICR a été stérilisée par 75% d’alcool éthylique pendant cinq minutes. Après avoir enlevé la fourrure de l’abdomen avec des forceps hémostatiques, désinfecter la zone avec 75% d’éthanol.
Couper la peau extérieure pour exposer la cavité abdominale. Injecter trois millilitres de RPMI stérile 1640 milieu dans l’abdomen. Puis masser l’abdomen pour détacher des cellules supplémentaires dans la solution.
Aspirer la suspension des cellules fœtales dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Après avoir centrifugé la suspension cellulaire pendant 10 minutes à 1000g, jetez le supernatant et suspendez les cellules fœtales pour obtenir une suspension cellulaire unique. Après cette procédure, dissoudre les cellules en utilisant le milieu HAT.
Comptez les cellules pour en faire 100 000 par millilitre de membres de la cellule. Transférer les cellules dans 96 plaques de culture cellulaire bien. Incuber les plaques pendant la nuit à 37 degrés, 5% de dioxyde de carbone.
La souris vaccinée choisie a été stérilisée par 75% d’alcool éthylique pendant cinq minutes. Aspirer RPMI 1640 moyen comme tampon de lavage. Retirez la peau et le tissu musculaire à l’aide de ciseaux pour exposer la rate.
Isoler soigneusement la rate par les pinces. Puis laver la rate dans le RPMI 1640. Isoler la rate et la couper en morceaux.
Pilonner lentement la rate. Ensuite, il a été traité avec un milieu RMPI 1640 pour dissoudre les cellules pour préparer une suspension cellulaire de la rate. Après cela, les cellules ont été filtrées par 800 passoire à cellules mailles.
Clouer la rate soigneusement pour enlever les gros tissus. Éviter les gros tissus influence la fusion des cellules. Était la suspension cellulaire de la rate avec RPMI 1640 moyen.
Puis la suspension cellulaire a été ajoutée dans le tube de centrifugeuse. Récolter les cellules de la rate par centrifugation à 1000g pendant 10 minutes. Et puis jeter le supernatant.
Les cellules de la rate étaient censées être d’un milliard à 10 milliards. Retirez les cellules myélomateuses cultivées et amplifiées de l’incubateur et secouez doucement le flacon pour obtenir une suspension cellulaire. A été la suspension avec RPMI deux fois.
Mélanger la suspension cellulaire de la rate et les cellules du myélome. Comptez les cellules et ajustez la concentration. La ration finale des cellules de la rate vers les cellules myélomateuses devrait être de un à cinq à un à 10.
Centrifuger le mélange cellulaire, puis enlever le supernatant. Ajouter un millilitre de solution de glycol de polyéthylène à 50% aux cellules et remuer doucement à 37 degrés pendant une minute. Debout pendant 30 secondes, ajouter deux millilitres de RPMI 1640 moyen et incuber à 37 degrés pendant deux minutes pour mettre fin à la réaction.
Ajouter dans deux millilitres RPMI pendant une autre minute. Ensuite, ajouter en 10 millilitres RPMI 1640. Centrifugeuse à 800g pendant 10 minutes.
Jeter le supernatant, ajouter la solution HAT et continuer à cultiver les cellules pendant sept jours à 37 degrés 5% de dioxyde de carbone. Après sept jours, les supernatants cellulaires dans 96 plaques de puits ont été aspirés après fusion cellulaire et ajoutés dans des plaques ELISA pré-enduites d’antigène de revêtement. Cultivé à 37 degrés pendant une heure, l’anticorps secondaire a été ajouté et cultivé pendant une demi-heure.
Après avoir ajouté 100 microlitres de solution de substrat. Arrêtez la réaction. Pour les plaques ELISA dans le lecteur de microplaque, méthode de point de terminaison a été utilisé lire les données à 450 nanomètres.
Absorption mesurée à 450 nanomètres et dépistage des hybridomas positifs. Utilisez la méthode de dilution limitante pour préparer les hybridomas monocolysaux. Après avoir retiré le milieu HD des hybridomas sélectionnés, suspendez les cellules de RPMI 1640 et comptez-les.
Diluer les cellules d’une concentration d’une cellule, deux cellules, et quatre cellules par puits par RPMI 1640 dans une plaque de puits 96 et la culture. Transférer les cellules des hybridomas qui sont positives à 24 plaques de puits, flacons de 25 et 75 centimètres carrés pour la culture. Conserver les myodomes dans une boîte de refroidissement dégradée à moins 80 degrés pendant 24 heures.
Ensuite, transférer à l’azote liquide pour le stockage à long terme. Le titer des antiserums ont été déterminés par ELISA indirect. La souris un à quatre a été vaccinée avec le conjugué narigin BSA était sensiblement plus élevé que la souris de contrôle sans immunisé.
Le litre de un à 5000 est une diffusion suffisante. Le poids moléculaire du conjugué hapten a été confirmé par l’analyse MALDI-TOF. Comme indiqué dans la figure deux, comme un poids moléculaire de la norme BSA et narigin ont été connus, nous pouvons calculer et déterminer que les molécules de narigin ont été conjuguées avec BSA.
Seul l’hybridoma peut survivre et se développer dans les médias de sélection HAT. Après sept jours de croissance, la culture cellulaire peut être testée par ELISA. Les hybridomas positifs ont été re-clonés et élargis.
Ces images montrent les résultats conventionnels pour les lignées cellulaires monoclonales et polyclonales stables d’hybridoma. Le point critique de cette expérience est le criblage des mAbs spécifiques pour l’hapten, mais pas la protéine porteuse. La spécificité du mAb a ensuite été examinée en présence d’autres composés structurellement apparentés.
La réactivité croisée a été calculée pour évaluer la spécificité de mAb à l’antigène. La courbe d’étalonnage de la naringine et la plage de revêtement ont été obtenues. Les hybridomes monoctones spécifiques à l’antigène ont été élargis et cryopréservés dans de l’azote liquide pour le stockage à long terme.
Après avoir regardé cette vidéo, j’espère que vous avez une bonne compréhension de la façon de générer des anticorps monoclonaux contre un petit composé moléculaire. C’est tout. Merci pour votre observation et bonne chance pour vos expériences.
