Ce protocole permet la fabrication d’analogues osseux sans nécessiter de chauffage ou de produits chimiques toxiques. De cette façon, les structures osseuses sont formées avec le potentiel de réparer un défaut osseux dans les milieux cliniques en utilisant les propres cellules d’un patient. Le principal avantage de la technique est que l’encre osseuse peut être imprimée avec des cellules vivantes pour former n’importe quelle structure osseuse complexe et pour diriger la différenciation vers la lignée formant l’os.
En outre, les médicaments peuvent être chargés dans l’encre osseuse pour améliorer simultanément la cicatrisation des plaies, la régénération osseuse et pour traiter des pathologies comme le cancer. La démonstration de la procédure sera assurée par Gagan Jalandhra, candidate au doctorat dans mon laboratoire, et le Dr Sara Romanazzo, qui a travaillé avec moi et le Dr Jalandhra sur divers projets, y compris le développement de cette technologie. Commencez par ajouter le mélange d’hydrogénophosphate de calcium et de poudre de carbonate de calcium à un creuset de zircone de sorte qu’il ne soit pas rempli à plus de 75%.
Transférer le creuset dans un four, le chauffer à 1 400 degrés Celsius à un taux de cinq degrés Celsius par minute et le maintenir pendant trois heures. Éteindre la réaction en retirant le creuset du four et en le laissant au sommet du bloc réfractaire. Laissez-le refroidir complètement avant de le manipuler.
Utilisez un mortier et un pilon pour casser et broyer le gâteau de phosphate alpha-tricalcique de sorte que les granulés obtenus aient une taille maximale de 200 micromètres. Ajouter trois boules de zircone stabilisées à l’yttrium de trois millimètres au mélange broyé, suivies d’éthanol à 100%. Fixez le couvercle et broyez pendant deux heures à 180 rotations par minute.
Récupérez la suspension et séparez les billes en utilisant 100% d’éthanol pour le lavage. Sécher la suspension dans un four à 120 degrés Celsius pendant 24 heures. Ajouter la poudre séchée dans les bocaux de mouture avec des boules de zircone d’un millimètre et 100% d’éthanol dans les mêmes rapports de poids qu’à la première étape.
Broyer pendant deux heures à 180 rotations par minute. Puis séparer et sécher au four. Retirer l’échantillon du four.
Pour faire l’encre osseuse, ajoutez 630 microlitres de glycérol et 130 microlitres de polysorbate 80 dans un pot de bille bil. Ajouter ensuite 100 milligrammes de phosphate d’ammonium dibasique et deux grammes de poudre de phosphate alpha-tricalcique à la solution et remuer continuellement avec une spatule pour combiner. Ajouter une boule de zircone de 25 millimètres, fixer le couvercle et le placer à l’intérieur d’un moulin planétaire pendant 60 minutes à 180 rotations par minute, en s’arrêtant à mi-chemin pour gratter les côtés du pot avec une spatule à l’aide d’une spatule.
Chargez l’encre dans une seringue d’un millilitre. Faire une solution à 10% de gélatine de type A dans 1X PBS comme décrit dans le manuscrit texte. Placer la fiole conique sur l’agitateur.
Ajoutez ensuite 5,796 millilitres d’anhydride méthacrylique et continuez à agiter dans l’obscurité à 50 degrés Celsius pendant 90 minutes. Éteindre la réaction en diluant deux fois le contenu des flacons coniques avec du PBS. Décanter dans des tubes de 50 millilitres et éliminer l’anhydride méthacrylique n’ayant pas réagi par centrifugation à 3000 RCF à température ambiante pendant trois minutes et collecte du surnageant.
Dialyser le surnageant à l’intérieur de tubes de dialyse en cellulose coupés de 14 kilodaltons contre de l’eau désionisée à 40 degrés Celsius pendant cinq jours tout en remuant doucement. Remplacez l’eau désionisée tous les jours. Préparez-vous pour le stockage en décantant dans des tubes de 50 millilitres, en fixant le bouchon et en le plaçant au réfrigérateur pendant 12 heures.
Ensuite, congelez les échantillons avec de l’azote liquide et lyophilisez immédiatement pendant cinq jours à moins 54 degrés Celsius et 0,4 millibars. Conservez la mousse obtenue dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius. Pour synthétiser les microgels GelMA, préparez une solution de GelMA à 10% poids par poids dans du PBS en pesant le GelMA lyophilisé, en l’ajoutant à un tube avec du PBS et en le chauffant au bain-marie à 50 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit complètement hydraté.
Ajoutez 37 millilitres d’huile par millilitre de solution de GelMA à un bécher, en veillant à ce qu’il ne soit pas rempli à plus de 65%. Installez un système de double bécher sur une plaque chauffante sous agitation magnétique en plaçant le bécher contenant de l’huile à l’intérieur d’un bécher plus grand. Chauffer à 40 degrés Celsius en remuant.
Chargez la solution GelMA dans une seringue et ajoutez-la goutte à goutte dans l’huile d’agitation à travers un filtre de 0,45 micromètre. Laissez l’émulsion s’équilibrer pendant 10 minutes. Réduire la température de l’émulsion à 15 degrés Celsius à thermiquement.
Stabilisez les sphères en ajoutant de la glace pilée dans l’espace entre les deux béchers. Ajouter de l’acétone à l’émulsion GelMA tournante. Décanter le contenu du bécher dans des tubes de 50 millilitres, en veillant à laver les parois du bécher avec de l’acétone.
Laisser reposer pendant 20 minutes pour permettre aux microgels déshydratés de se déposer au fond. Jeter le surnageant et laver les microgels deux fois avec de l’acétone. Consolider dans un tube, remplir d’acétone et soniquer pendant 10 secondes.
Encore une fois, lavez-le deux fois avec de l’acétone. Conserver dans de l’acétone à température ambiante jusqu’à ce qu’elle soit nécessaire pour l’impression. Pour préparer la suspension de microgel GelMA pour l’impression, formuler une solution à 1% poids par poids de GelMA dans DMEM comme décrit dans le manuscrit texte.
Évaporer l’acétone des microgels déshydratés et peser la poudre obtenue dans un tube. Ajouter l’acétone et transférer dans un environnement stérile. Pour former la suspension de microgel, évaporez l’acétone de la poudre à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité.
Après évaporation, ajouter du DMEM, une solution de GelMA à 1% dans du DMEM et une solution initiatrice LAP à 2,5% pour obtenir une fraction d’emballage finale de 30%Laisser hydrater complètement pendant au moins 12 heures à température ambiante. Culture des cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux dans du DMEM à faible teneur en glucose supplémenté en 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à confluence. Retirer les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu en retirant le milieu et en les lavant avec du PBS stérile.
Enduire les cellules par centrifugation à 150 RCF à température ambiante pendant cinq minutes. Comptez les cellules et calculez au moins 5 x 10 aux cinq cellules pour chaque millilitre de microgels GelMA. Attribuer le volume requis de la suspension cellulaire à un tube et à une pastille séparés, comme démontré précédemment.
Retirer délicatement autant de surnageant que possible à l’aide d’une pipette, en ne laissant que la pastille de cellule. Ajouter le volume requis de suspension de microgel à la pastille et pipeter doucement de haut en bas pour assurer une distribution uniforme. Charger la cellule chargée en suspension de microgel dans un réacteur à l’aide d’une pipette.
À l’aide d’une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 23, déposer l’encre osseuse, réticuler la cellule et les constructions de microgel GelMA chargées d’encre osseuse avec une lampe de réticulation UV à 405 nanomètres pendant 90 secondes. Transférer immédiatement la suspension de microgel sur une plaque de puits de taille appropriée contenant du DMEM complet. Incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Remplacez le milieu de culture après 24 heures, puis toutes les 48 à 72 heures au besoin. L’encre osseuse a été analysée par microscopie électronique à balayage pour déterminer sa microstructure, qui a montré la formation de cristaux d’hydroxyapatite après prise d’encre, particulièrement visible dans des conditions sèches. Dans cette étude, les cellules ont été mélangées avec des microgels GelMA et conservées en culture jusqu’à cinq jours, soit en suspension de microgel uniquement, soit dans le système COBICS.
Les cellules ont montré une bonne viabilité en présence de l’encre osseuse, à la fois le premier et le cinquième jour, confirmant que les produits de lixiviation de l’encre n’étaient pas nocifs pour les cellules. Il est crucial de contrôler la vitesse de l’agitateur tout en synthétisant le microgel, car de légers changements peuvent entraîner des différences de taille. Il est également important d’assurer une distribution homogène des cellules dans la suspension de microgel.
Le même protocole peut être utilisé pour imprimer à l’intérieur des suspensions de microgel de gélatine, qui agissent comme des supports sacrificiels, laissant derrière eux des constructions osseuses autonomes. Mais l’utilisation de GelMA ouvre la voie à des constructions multiphasiques à pot, telles que les interfaces ostéochondrales ou tendineuses osseuses.
