Ce modèle permettra aux chercheurs aux stades précliniques critiques de déterminer avec plus de précision l’efficacité antimicrobienne des nouvelles formulations et donnera aux chercheurs un plus grand contrôle sur la conception et la formulation des médicaments. Ce modèle permet des résultats rapidement reproductibles dans un environnement de plaie représentatif. Il réduit le besoin d’animaux élevés à des fins spéciales et facilite la traduction plus rapide des antimicrobiens topiques pour les infections des plaies à la clinique.
Les principaux défis sont la contamination et la dextérité. Une technique aseptique stricte et la patience avec le traitement des tissus sont essentielles; un retrait précis et ciblé du lambeau est nécessaire pour le succès de cette méthode. Commencez par la désinfection des forceps en les exposant à une stérilisation à la chaleur sèche à 200 degrés Celsius pendant une heure.
Autoclaver toute la verrerie à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes avant utilisation. Désinfectez la section frontale de la lampe en versant environ 100 millilitres de solution de dioxyde de chlore à 200 ppm sur la zone d’échantillonnage. Raser la section frontale à l’aide d’une tondeuse électrique, suivie d’un lavage avec 200 millilitres de solution de dioxyde de chlore à 200 ppm.
Essuyez la zone avec de l’éthanol et un rouleau bleu, et couvrez la zone d’échantillon avec de la crème dépilatoire. Après 35 minutes, grattez doucement la crème dépilatoire à l’aide d’un outil de grattage et évaluez la zone d’échantillonnage. Répétez le processus d’épilation s’il reste une quantité importante de poils.
Rincer la zone d’échantillon propre avec 200 millilitres de solution de dioxyde de chlore suivie d’éthanol et d’un rouleau bleu. Utilisez un poinçon de biopsie stérile de huit millimètres pour découper un échantillon de peau de huit millimètres de la zone préparée. Ensuite, retirez l’échantillon à l’aide d’une pince stérile et d’un scalpel à lame numéro 15, en veillant à ce que toute la graisse cutanée soit éliminée.
Placez les échantillons dans un pot stérile de 0,5 litre rempli de PBS stérile. Ensuite, transférez-les dans des tubes stériles de 50 millilitres remplis de 50 millilitres de solution de dioxyde de chlore de 200 ppm. Retourner le tube deux fois et le laisser stériliser pendant 30 minutes.
Transférer les échantillons dans un tube de 50 millilitres rempli de 40 millilitres de PBS stérile. Après le lavage PBS, placez chaque échantillon de peau dans un puits séparé d’une assiette de 24 puits. Ajouter 350 microlitres du milieu préchauffé dans un puits, tout en maintenant l’échantillon à l’interface air-liquide.
Scellez les plaques de 24 puits avec un joint de plaque perméable aux gaz avant de placer la plaque pour l’incubation dans un incubateur de tissus humidifiés à 5% de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après l’incubation, retirer le milieu de culture et rincer les échantillons dans 500 microlitres de PBS stérile. Retirez les antibiotiques résiduels de l’échantillon en les traitant avec des milieux sans antibiotiques à 5% de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius pendant 24 heures.
Si une turbidité ou une infection fongique se développe dans le milieu exempt d’antibiotiques, jeter l’échantillon. Ensuite, préparez un tube de 50 millilitres avec 10 millilitres de bouillon de soja tryptique stérile. Ensuite, transférez plusieurs colonies de Staphylococcus aureus d’une plaque de gélose fraîche de S. aureus au bouillon et incuber le tube à 37 degrés Celsius et 150 RPM pendant 18 heures.
Après avoir centrifugé les tubes à 4 000 G pendant trois minutes, retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 10 millilitres de PBS stérile. Répétez le lavage PBS deux fois avant d’ajuster l’inoculum à une densité optique de 0,6 à des longueurs d’onde de 600 nanomètres à l’aide de PBS stérile. Confirmer la charge d’inoculum par une numération manuelle sur plaque viable.
Pour infecter l’échantillon de peau, préparez une nouvelle plaque de 24 puits avec 400 microlitres de milieu préchauffé sans antibiotique et ajoutez les 24 inserts de puits à l’aide de pinces stériles. Retirez le média des échantillons de peau. Lavez-les avec 500 microlitres de PBS stérile et retirez le lavage.
Utilisez des pinces stériles pour maintenir doucement l’échantillon au fond du puits. Utilisez une biopsie à l’emporte-pièce de quatre millimètres pour percer l’échantillon de peau à une profondeur approximative d’un à deux millimètres et faire un lambeau central de la plaie. Utilisez ensuite un scalpel à lame numéro 15 et une pince à tissus Allis à dents stériles pour enlever la couche supérieure du lambeau de la plaie.
Une fois que tous les échantillons ont été blessés, transférez-les dans les 24 inserts de puits à l’aide de pinces stériles. Pipeter 15 microlitres de l’inoculum bactérien dans le lit de la plaie avant d’incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur de tissus humidifiés. Pour des périodes d’incubation plus longues, retirez le média, remplacez-le par un média frais toutes les 24 heures et incuber les plaques dans les mêmes conditions.
Pour déterminer la charge bactérienne, retirez le média du fond des puits. Et à l’aide de pinces stériles, transférez chaque échantillon dans un tube séparé de 50 millilitres rempli d’un millilitre de PBS stérile. Ensuite, détachez les bactéries de la surface du lit de la plaie en homogénéisant la surface de l’échantillon avec un homogénéisateur à pointe fine.
Assurez-vous que le lit de la plaie est en contact direct avec l’extrémité de l’homogénéisateur. Une fois tous les échantillons traités, vortex chaque échantillon avant de transférer 20 microlitres d’homogénat dans le puits correspondant d’une plaque de 96 puits contenant 180 microlitres de PBS stérile. Diluer en série chaque homogénat d’échantillon à 1 fois 10 au négatif 7, et pipeter 10 microlitres de l’homogénat dilué sur une plaque de gélose de soja tryptique en trois exemplaires.
Incuber la plaque de gélose au soja tryptique à 37 degrés Celsius et, après 18 heures, compter le nombre de colonies pour déterminer les unités formant des colonies ou UFC pour chaque échantillon. Un régime approprié de stérilisation de la peau a été identifié en utilisant différents traitements pour des durées variables. L’intégrité des tissus a été surveillée par histologie, suivie d’une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine immédiatement après le traitement.
Un traitement de 30 minutes au dioxyde de chlore était le traitement le plus efficace, avec stérilisation reproductible du tissu cutané tout en préservant l’intégrité des tissus. Une pellicule blanche dans le lit de la plaie était évidente sur le tissu 48 heures après l’infection. Bien que le modèle de rayure abritait un nombre moyen plus élevé d’UFC après 24 heures, la technique de blessure par enlèvement de lambeau a produit des résultats plus cohérents.
Après 48 heures, environ 100 fois plus d’UFC bactériennes ont été récupérées dans le tissu blessé par rapport à l’inoculum, indiquant une infection réussie. Des coupes histologiques colorées de Gram du tissu infecté indiquaient la présence de cellules de S. aureus dans le lit de la plaie, qui était absente dans les sections de tissu non infecté. En suivant cette procédure, on peut effectuer une immunohistochimie pour étudier la réponse tissulaire, la coloration de Gram modifiée pour visualiser la localisation bactérienne et la numération sur plaque viable après une exposition aux antimicrobiens pour tester l’efficacité antimicrobienne.
Pour les chercheurs qui mettent au point de nouveaux antimicrobiens, ce modèle permettra de mieux contrôler l’optimisation des prospects, de réduire la dépendance à l’égard d’essais coûteux et étroitement réglementés sur les animaux et de permettre la traduction rapide des antimicrobiens en clinique.
