Dans cet article, nous présentons un protocole ex vivo optimisé pour les plaies cutanées humaines qui peut fournir des données d’efficacité importantes dans le cadre d’un pipeline translationnel clinique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une évaluation précise à haut débit de la réparation des plaies dans la peau humaine vivante. Elizabeth Roberts, chercheuse postdoctorale, et Alexandria Kidd, assistante de recherche de notre laboratoire, feront la démonstration de la procédure.
Pour préparer un échantillon de tissu cutané pour la plaie, placez le derme cutané vers le bas dans une boîte de Petri de 90 millimètres et utilisez des ciseaux stériles pour enlever le tissu adipeux. Lorsque toute la graisse a été enlevée, placez la peau dans 25 millilitres de HBSS complétés par des antibiotiques pendant 10 minutes à température ambiante avec des secousses intermittentes pour éliminer tout sang résiduel dans le tissu adipeux. Après 10 minutes, rincez la peau dans 25 millilitres de DPBS.
Après 10 minutes, répétez le rinçage HBSS sans antibiotiques, puis effectuez un rinçage final dans 25 millilitres de DPBS. Ensuite, placez une membrane filtrante stérile en nylon sur la pile de tampon absorbant et séchez le côté dermique de la peau sur de la gaze stérile dans une boîte de Petri de 90 millimètres pour éliminer le DPBS résiduel. Placez le derme de la peau séchée sur un couvercle de boîte de Petri propre de 90 millimètres pour éliminer tout DPBS résiduel et tamponnez l’épiderme avec de la gaze stérile fraîche.
Pour créer une plaie, appuyez sur un coup de biopsie de deux millimètres contre la peau tout en maintenant la peau serrée et en la tordant doucement. À l’aide d’une pince à tissu denté incurvé, ramassez chaque côté de la plaie d’environ deux millimètres de diamètre et crochetez des ciseaux Iris incurvés sous la plaie. Utilisez un poinçon de biopsie de six millimètres pour biopsier autour de la plaie centrale de deux millimètres pour créer une explantation de six millimètres avec une plaie partielle d’épaisseur de deux millimètres au centre.
Ensuite, placez l’épiderme de l’explantation de la plaie sur la pile de membranes filtrantes en nylon pour une incubation d’un à sept jours à 32 à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Pour la coloration fluorescente, recueillir les explantes de plaie dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de fixateur cutané par tube et incuber les explantes pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, remplacez le fixateur par un millilitre de tampon de lavage de coloration.
Après le lavage, couvrir chaque échantillon avec environ 150 microlitres de tampon bloquant et incuber pendant une heure à température ambiante. Après avoir retiré le tampon bloquant, ajoutez 150 microlitres d’anticorps primaire dilués dans un tampon bloquant par tube et incubez les explantations de la plaie pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, rincez les échantillons avec 500 microlitres de tampon de lavage de coloration contenant 0,2% d’azide de sodium suivi de trois rinçages dans un tampon de lavage régulier.
Après le lavage, ajouter 150 microlitres d’un anticorps secondaire conjugué à la florescence approprié dilué dans un tampon de lavage de coloration à chaque puits pour une incubation d’une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation, rincer l’explante trois fois pendant 30 minutes dans 500 microlitres de tampon de lavage de coloration par lavage avant de contre-tacher chaque explante avec 150 microlitres de DAPI pendant 10 minutes à température ambiante. Enfin, lavez l’explantation deux fois pendant 30 minutes avec 500 microlitres de tampon de lavage par lavage.
Pour l’imagerie explant, placez une boîte de Petri de 60 millimètres sur la plate-forme d’imagerie d’un microscope confocal et ajoutez une couche d’environ un millilitre de DPBS à la boîte. Utilisez des pinces pour transférer les explantations de la plaie dans le plat. Après avoir configuré le logiciel d’imagerie approprié pour l’expérience, placez la plaie au centre du plan d’imagerie et obtenez des images des biopsies de la plaie.
Pour effectuer une imagerie au microscope numérique sans fil afin d’obtenir des images de haute qualité de manière rentable, connectez un téléphone ou un ordinateur portable à un microscope numérique sans fil. Placez les explants enroulés sur un morceau de tissu de laboratoire et retirez tout tampon de lavage résiduel de l’échantillon. Positionnez ensuite l’explant au centre du champ de vision du microscope et acquérez des images à l’aide de la caméra connectée.
L’immunoperoxydase et l’immunofluorescence peuvent être utilisées pour la coloration des tissus de la monture entière. En outre, la coloration vivante / morte peut être effectuée sur des tissus frais et imagée avant ou après la fixation. La coloration complète des plaies peut être utilisée pour déterminer les taux de fermeture des plaies de manière reproductible.
Dans cette analyse représentative, une fermeture saine de la plaie cutanée a été observée après quatre à cinq jours, tandis que les plaies cutanées diabétiques n’ont pas réussi à se refermer complètement au cours de la période d’analyse de sept jours. L’expression de K14 a culminé le deuxième jour dans les plaies cutanées saines avant de diminuer rapidement avec une différenciation épidermique accrue. Cette réétitélialisation et la différenciation épidermique subséquente ont été retardées dans les plaies cutanées diabétiques.
La reformation de la barrière épidermique précoce exclut la pénétration de l’anticorps K14 dans les couches épidermiques différenciées. Au début du processus de réépithélialisation, les kératinocytes de la couche basale K14 positive migrent vers l’intérieur sur la plaie ouverte, de sorte que l’épiderme plus proche du bord externe de la plaie se forme plus tôt que l’épiderme plus près du bord interne de la plaie. Plus tard dans la phase de réparation, la coloration K14 est perdue car l’épiderme se différencie de l’extérieur vers l’intérieur.
La coloration de montage entier peut également être utilisée pour étudier l’expression et la localisation d’autres marqueurs pertinents de la plaie dans la peau, ainsi que la présence de cellules immunitaires d’intérêt sur le site de la plaie à différents stades de cicatrisation. Générer des plaies excisionnelles reproductibles peut être difficile au début. Nous vous conseillons de pratiquer la procédure de blessure en utilisant un surplus de peau.
