Ces modèles peuvent être mis en œuvre pour évaluer divers aspects de la réponse à la cicatrisation des plaies, y compris la cinétique cellulaire et cytokine et la fermeture des plaies. Le modèle éponge PVA permet la récupération de millions de leucocytes de plaie pour les analyses phénotypiques et fonctionnelles, tandis que le modèle d’excision de la peau de la queue permet la visualisation facile des plaies à guérison lente. L’éponge PVA et les modèles excisionnels de blessure de queue peuvent être utilisés en conjonction avec des conditions comorbides, telles que le diabète ou la pneumonie, pour comprendre leur impact sur la cicatrisation des plaies.
Bill Henry, assistant de recherche de mon labo, démontrera les procédures avec Meredith Crane. Avant de commencer l’expérience, utilisez des ciseaux pour couper les feuilles d’éponge PVA en morceaux de huit par huit par quatre millimètres. Réhydrater les morceaux d’éponge dans le PBS stérile dans un bécher pendant 10 minutes avant de stériliser automatiquement les éponges dans le PBS.
Lorsque les éponges se sont refroidies, conservez les éponges immergées dans le PBS à quatre degrés Celsius. Le jour de la procédure, placez six éponges par animal expérimental dans un plat de culture stérile dans une hotte stérile d’écoulement laminaire, et confirmez un manque de réponse au pincement d’orteil dans une souris anesthésiée, de huit à 12 semaines, mâle, C57-Noir/6. Demandez à un assistant d’utiliser des tondeuses pour enlever les cheveux le long du dorsum et de la gaze stérile pour appliquer la solution povidone-iode à la zone rasée à deux reprises, suivie d’une seule application d’éthanol à 70 %.
L’assistant doit ensuite transférer la souris sur des rideaux chirurgicaux stériles placés sur un coussin chauffant. Porter des gants stériles, utiliser des forceps pour tirer la peau dorsale loin du tissu sous-jacent, et utiliser des ciseaux chirurgicaux stériles pour faire une incision de deux centimètres le long de la ligne médiane dorsale d’environ deux centimètres antérieur à la base de la queue. Tenir l’incision ouverte avec des forceps stériles, utiliser stérile, incurvé, ciseaux chirurgicaux à pointe émoussée pour former une poche sous-cutanée le long du dorsum dans l’une des positions comme indiqué dans la figure.
Une fois que les ciseaux ont été insérés, ouvrez et fermez les pointes deux fois pour former une poche assez grande pour tenir une éponge insérée. Lorsque la poche a été créée, utilisez des ciseaux chirurgicaux stériles pour presser doucement une éponge PVA dans le plat de culture pour enlever l’excès de PBS. Ensuite, soulevez l’éponge d’un coin, et, menant avec le coin tenu par les ciseaux, placez l’éponge dans la poche sous-cutanée.
Lorsque les six éponges ont été placées comme démontré, utilisez des forceps stériles pour pincer la peau dorsale incisée ensemble, et fermer l’incision avec deux pinces à plaies en acier inoxydable. Pour l’isolement de fluide d’éponge de PVA, un à 14 jours après implantation, enlevez les agrafes chirurgicales, et ouvrez l’incision avec des forceps dentés. Utilisez des ciseaux pour étendre l’incision le long de la ligne médiane dorsale, et utilisez des forceps pour extraire une éponge de sa poche sous-cutanée.
Placez l’éponge dans le canon d’une seringue de cinq millilitres nichée dans un tube de culture de 16 millilitres sur la glace, et utilisez des ciseaux pour dissocier tout tissu conjonctif qui reste adhérent à la surface de l’éponge, au besoin. Lorsque toutes les éponges ont été extraites et transférées comme démontré, centrifugez le tube de culture pour recueillir le liquide de plaie. Pour isoler les cellules des éponges PVA, après avoir recueilli les éponges comme nous venons de le démontrer, placez-les dans un tube conique de 15 millilitres contenant cinq millilitres de milieu de collecte HBSS.
Lorsque toutes les éponges ont été ramassées, décanter la suspension de l’éponge dans un sac de mélangeur de 80 millilitres, et accrocher le sac de l’écoutille du mélangeur à aubes de sorte que les palettes frapperont les éponges et le milieu. Réglez le mélangeur à pagaie à courir à haute hauteur pendant 60 secondes, et appuyez sur démarrer. Lorsque le mélangeur s’est arrêté, presser les éponges dans le sac pour libérer complètement le milieu, et utiliser une pipette pour transférer le milieu du sac de mélangeur dans le tube de 15 millilitres.
Ajustez les réglages du mélangeur à pagaie pour qu’il s’exécute pendant 30 secondes à feu vif et ajoutez cinq millilitres de milieu au sac de mélangeur. Répétez le processus d’estomac deux fois de plus avant de centrifuger le tube de milieu recueilli. Une pastille rouge de cellules et de globules rouges doit être visible au fond du tube conique.
Mélanger 900 microlitres d’eau distillée avec les cellules pendant trois à cinq secondes avant de neutraliser la lyse avec 100 microlitres de 10x PBS et quatre millilitres de 1x PBS. Recueillir les cellules par centrifugation, et résuspendre la pastille de cellules blanches dans le milieu approprié pour l’analyse en aval. Pour créer une plaie de la peau de la queue, après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des orteils chez la souris anesthésiée, de huit à 12 semaines, mâle, C57-Black/6, utilisez la gaze stérile pour appliquer la solution povidone-iode deux fois sur le site chirurgical, suivie d’une application de 70% d’éthanol.
À l’aide d’un marqueur permanent et d’un modèle préfabriqué, tracez une section de 10 x 3 millimètres sur la surface dorsale de la queue, à 10 millimètres de la base arrière et placez la souris sur des rideaux chirurgicaux stériles. Portant des gants chirurgicaux stériles, utilisez une lame stérile de scalpel pour faire une incision pleine épaisseur le long des bords droit, inférieur et gauche de la zone de la plaie. À l’aide de forceps stériles, peler la peau excisée de la queue et utiliser des ciseaux chirurgicaux stériles pour couper le bord supérieur de la zone de la plaie.
Utilisez de la gaze stérile pour appliquer une pression sur la plaie pour arrêter de saigner et appliquez un film de barrière de pulvérisation sur le lit de la plaie. Photographiez ensuite les plaies à une distance fixe à intervalles réguliers et analysez les photographies par analyse planimétrique afin de déterminer les mesures de la zone de la plaie. La chirurgie d’implantation d’éponge de PVA génère une réponse inflammatoire systémique, comme démontré par l’induction d’IL-6 dans le plasma un jour après blessure.
Le nombre de cellules qui peuvent être récupérées des blessures d’éponge de PVA augmente au fil du temps, avec des neutrophiles, des monocytes, et des macrophages comprenant les populations primaires d’infiltration cellulaire dans les éponges. Les neutrophiles sont identifiés comme des cellules ly6G-positives, siglec-F-négatives. Les cellules siglec-F-positives sont principalement des éosinophiles.
Gating sur les cellules ly6G-négatives, Siglec-F-négatives permet l’identification des monocytes et des macrophages F4/80-positifs. Les cellules F4/80-positives peuvent être différenciées davantage par leur expression Ly6C pour distinguer les monocytes inflammatoires élevés de Ly6C et les macrophages bas monocyte-dérivés de Ly6C. Le modèle excisionnel de peau de queue fournit une alternative à la méthode dorsale de biopsie de poinçon de peau pour étudier la fermeture de blessure dans la peau ferme manquant de fourrure dense.
La fermeture de la plaie peut être quantifiée en mesurant la zone du lit de plaie au fil du temps. La plaie de la peau de la queue peut également être observée en coupe transversale par analyse histologique par l’intermédiaire de la coloration trichrome de H et E et Masson. Dans ces images, les marges latérales de la peau excisée sont indiquées par les pointes de flèches sur la surface dorsale de la queue.
Pour comprendre la cicatrisation des plaies à l’état stable, des composés thérapeutiques ou des interventions peuvent également être testés par leur injection directement dans l’éponge PVA ou par la livraison au lit de la plaie de la queue.
