Les informations structurelles sur la façon dont les enzymes de réparation par excision de base éliminent les lésions de l’ADN dans le contexte de la chromatine ont été rares. Cela constitue une lacune importante dans notre compréhension des mécanismes impliqués dans l’étiologie des maladies humaines. Le principal avantage de notre protocole est que nous avons optimisé la préparation des échantillons à l’aide d’équipements de laboratoire standard.
Cela permettra à d’autres biochimistes dans le domaine de compléter leur travail biochimique avec des études cryo-EM techniquement réalisables. Notre protocole peut également être utilisé pour étudier comment d’autres facteurs, y compris les facteurs de transcription pionniers, engagent le nucléosome. Il s’agit d’un domaine où l’information structurelle a également été limitée.
L’optimisation de la préparation des échantillons avant de passer aux conditions de congélation était essentielle pour faire avancer notre projet, et cela est mieux fait avec des tests biochimiques standard dans des conditions de conception de substrat, de liaison et de réticulation. Pour commencer, incuber le PCN et le facteur de réparation de l’ADN d’intérêt sur la glace pendant 15 minutes en utilisant un tampon optimal pour le complexe spécifique. Ensuite, ajoutez le glutaraldéhyde à une concentration finale de 0,005%Après l’avoir bien mélangé, incuber à température ambiante pendant 13 minutes.
Tremper avec une molaire Tris-CL à une concentration finale de 20 millimolaires Tris-CL avec un pH de 7,5. Ensuite, concentrer à environ 50 microlitres et échanger le tampon avec le tampon de congélation à l’aide d’une colonne de dessalage. Ensuite, déterminez les absorbances à une densité optique de 280 et 260 nanomètres et concentrez-vous davantage si nécessaire pour atteindre 1,3 à 3 milligrammes par millilitre sur la base d’une densité optique de 280 nanomètres.
Après avoir préparé le bouton de dialyse, placez le bouton contenant l’échantillon sur un lit de polyéthylène glycol avec la membrane vers le bas. Pour effectuer la purification par chromatographie d’exclusion de taille, laver et équilibrer une colonne d’exclusion de taille avec 60 millilitres d’eau distillée, suivie de 80 millilitres de tampon de congélation pendant une nuit à raison de 0,4 millilitre par minute. Ensuite, analysez immédiatement les fractions de pointe et concentrez les fractions contenant la protéine d’infusion MBP-PolBeta-APE1 de l’histone.
Elizabeth Viverette, une stagiaire post-baccalauréat du noyau cryo-EM ici aux NIH, fera la démonstration des procédures suivantes. Après avoir allumé le congélateur et rempli l’humidificateur de 50 millilitres d’eau distillée, réglez la température de la chambre à 22 degrés Celsius et l’humidité à 98%Ensuite, placez la tasse d’éthane et la tasse d’azote liquide dans les porte-espace respectifs. Ensuite, couvrez la tasse d’éthane avec le distributeur de couvercle en éthane et versez soigneusement de l’azote liquide dessus tout en remplissant la tasse d’azote liquide.
Lorsque le niveau d’azote liquide s’est stabilisé et atteint 100% et que la température atteint moins 180 degrés Celsius, ouvrez soigneusement la valve d’éthane et remplissez le gobelet d’éthane jusqu’à ce qu’il forme une bulle sur le couvercle transparent. Retirez ensuite le distributeur d’éthane. Placez deux papiers filtres sur le buvardeur et fixez-les avec un anneau métallique.
Allez dans la configuration et définissez les paramètres de buvard comme décrit dans le manuscrit, puis sélectionnez A-Plunge et cliquez sur OK. Sur l’écran principal, cliquez sur Pinces de charge et chargez-les avec une grille avec le côté d’application du carbone orienté vers la gauche. Calibrez les pinces, en ajustant l’axe Z pour assurer une tache solide. Cliquez sur Chambre inférieure et appliquez trois microlitres du complexe.
Cliquez ensuite sur Blot A-Plunge, qui fera pivoter la grille pour éponger de l’avant et la congeler. Après le transfert, stockez la grille dans la boîte à grille de la chambre à azote liquide. Lorsque les quatre grilles ont été congelées et placées dans la boîte de grille, tournez le couvercle en position neutre où toutes les grilles sont couvertes par le couvercle et serrez la vis.
Avant de charger les échantillons au microscope, placez les grilles vitrifiées sur un anneau et fixez-le à l’aide d’un clip C sous azote liquide dans une pièce à humidité contrôlée pour éviter la contamination par la glace. Lors du chargement du microscope, insérez les grilles dans une cassette à 12 fentes. Mélangez la cassette dans une capsule nanocab et chargez-la dans le chargeur automatique.
Ensuite, transférez la grille de la cassette à l’étage du microscope. Ajustez la scène à la hauteur eucentrique en faisant osciller la scène de 10 degrés et en déplaçant simultanément la hauteur Z jusqu’à ce qu’un décalage planaire minimal soit observé dans les images. Une fois la hauteur eucentrique atteinte, commencez l’imagerie en prenant une image de montage 3 par 3 de la grille dans laquelle chaque montage est pris à un grossissement de 62x pour obtenir l’atlas.
Après avoir choisi trois carrés de tailles variables et pris la hauteur eucentrique, image à un grossissement de 210x. Une fois qu’un carré est imagée, choisissez un trou chacun du bord, du centre et entre les carrés. Ensuite, imagez chaque trou à un grossissement de 2 600x.
Prenez l’image à fort grossissement à partir du centre du trou à un grossissement de 36 000x et à un temps d’exposition de 7,1 secondes, 60 images, une taille de 1,18 pixel et une mise au point de trois micromètres. Voir des images représentatives du dépistage. Pour déterminer le rapport NCP / MBP-PolBeta-APE1 pour former un complexe stable, des tests de déplacement de mobilité électrophorétique ont été effectués, qui ont montré une bande du NCP à déplacement unique avec un excès molaire quintuplé de MBP-PolBeta-APE1.
En plus petit volume, l’assemblage du complexe NCP-PolBeta-APE1 a démontré que l’échantillon était trop réticulé et a donné lieu à des agrégats sans complexes individuels discernables. Cependant, une dilution décuplée dans les PCN a permis de réduire considérablement l’agrégation et d’améliorer la stabilité des particules. Les méthodes de gel préparatif et d’exclusion de taille peuvent être combinées lorsque le gel préparatif améliore la qualité des NCP lorsqu’ils contiennent une quantité importante d’agrégats de poids moléculaire élevé, suivie de la purification du complexe par exclusion de taille.
Les résultats montrent que les deux méthodes peuvent être utilisées indépendamment pour générer des complexes stables. De plus, les données recueillies à partir des deux grilles montrent des classes bidimensionnelles et des cartes tridimensionnelles presque identiques à une résolution d’environ 3,2 angströms. Un rapport optimal entre le NCP et le facteur de réparation de l’ADN doit d’abord être déterminé, puis la réticulation du complexe avec le glutaraldéhyde doit être effectuée au moins 10 fois plus diluée que la concentration nécessaire pour la congélation.
Après avoir obtenu une carte 3D cryo-EM du complexe, un raffinement structurel supplémentaire sera nécessaire pour déterminer comment le facteur de réparation de l’ADN est trouvé et identifier quelles régions sont importantes pour ces interactions.
