La cryo-microscopie électronique monoparticule est la méthode de détermination structurée des macromolécules à une résolution proche de l’atome. Plusieurs progiciels sont disponibles pour le traitement d’images et les calculs de structure, mais le résultat sur les cartes 3D varie souvent en qualité et en résolution en raison des différences dans les algorithmes appliqués lors des calculs. Ainsi, l’utilisation d’une combinaison de différents programmes est souvent bénéfique pour obtenir les résultats optimaux.
Ce protocole guide les utilisateurs pour naviguer dans le flux de travail sur trois plates-formes de traitement cryo-EM différentes : CryoSPARC, RELION et Scipion. Nous allons montrer comment utiliser ce pipeline pour obtenir une structure à haute résolution du virus adéno-associé qui est un vecteur largement utilisé pour la thérapie génique. Après avoir ouvert CryoSPARC v3 dans un navigateur Web et créé l’espace de travail pour le projet, accédez au nouvel espace de travail et ouvrez le générateur de tâches sur le panneau de droite.
Cliquez sur importer des films et fournissez le chemin des films et obtenez le chemin du fichier de référence. Définissez ensuite les paramètres d’acquisition. Ensuite, cliquez sur la file d’attente, sélectionnez une voie pour exécuter le travail et un espace de travail et cliquez sur créer.
Ouvrez la correction de mouvement du patch et la carte de travail d’importation de films. Faites ensuite glisser la sortie imported_movies vers l’espace réservé des films sur la nouvelle tâche et mettez la tâche en file d’attente. Pour effectuer la fonction de transfert de contraste ou l’estimation CTF, ouvrez l’estimation CTF du patch.
Entrez les micrographies générées et mettez la tâche en file d’attente. Pour inspecter les micrographies moyennes et corrigées par le CTF et sélectionner un sous-ensemble pour un traitement ultérieur, ouvrez les expositions de curate, entrez les expositions obtenues à l’étape précédente et mettez le travail en file d’attente. Une fois que la tâche est en mode d’attente, cliquez sur l’onglet interactif de la fiche de travail.
Ajustez les seuils de paramètres et acceptez ou rejetez des micrographies individuelles pour un traitement ultérieur. Lors du traitement des données actuelles, fixez le seuil supérieur d’astigmatisme à 400 angströms, la résolution CTF à cinq angstroms et l’épaisseur relative de la glace à deux. Cliquez ensuite sur terminé pour sélectionner les micrographies à traiter en aval.
Pour le prélèvement manuel, ouvrez le sélecteur manuel. Entrez les expositions acceptées et mettez la tâche en file d’attente. Cliquez ensuite sur l’onglet interactif, réglez la taille de la boîte sur 300 pixels et cliquez sur quelques centaines de particules sur plusieurs micrographies, évitant ainsi le chevauchement des particules.
Une fois la sélection terminée, cliquez sur Terminer la sélection des particules d’extrait. Ensuite, pour générer des modèles de prélèvement automatisé de particules, cliquez sur classification 2D et entrez les pics de particules générés. Modifiez ensuite le nombre de classes 2D à 10 et mettez le travail en file d’attente.
Ensuite, ouvrez sélectionner des classes 2D et entrez les particules et les moyennes de classe obtenues à l’étape précédente. Cliquez ensuite sur l’onglet interactif, sélectionnez des classes 2D représentatives avec un bon rapport signal/bruit et cliquez sur terminé. Pour la sélection de particules basée sur des modèles, ouvrez le sélecteur de modèles et entrez les classes 2D et les micrographies sélectionnées.
Réglez ensuite le diamètre des particules sur 220 angströms et mettez le travail en file d’attente. Enfin, ouvrez l’extrait des micrographies et entrez les micrographies et les particules obtenues lors de l’inspection des pics de particules. Définissez ensuite la taille de la boîte extraite sur 300 pixels et mettez la tâche en file d’attente.
Pour la classification 2D, cliquez sur Classification 2D et entrez les particules extraites. Définissez ensuite le nombre de classes 2D sur 50 et mettez la tâche en file d’attente. Ensuite, ouvrez sélectionner des classes 2D et entrez les particules obtenues et les moyennes de classe.
Cliquez sur l’onglet interactif. Choisissez des classes 2D en fonction de la résolution et du nombre de particules dans la classe et cliquez sur terminé. Pour générer un volume 3D initial, ouvrez la reconstruction ab-initio et entrez les particules à partir de la classification 2D finale.
Ajustez ensuite la symétrie à l’icosaédrique et mettez le travail en file d’attente. Ensuite, ouvrez le raffinement homogène, entrez le volume de l’étape précédente et les particules de la classification 2D finale. Modifiez ensuite la symétrie et mettez la tâche en file d’attente.
Lorsque le travail est terminé, inspectez la corrélation de la coque de Fourier ou la courbe FSC et téléchargez le volume à examiner dans UCSF Chimera. Dans CryoSPARC v3, ouvrez la fiche de travail de la tâche de classe 2D sélectionnée à partir de la classification 2D finale. Ensuite, dans l’onglet détails, cliquez sur exporter le travail.
À l’aide de PyEM, convertissez le particles_exported. cs au format étoile en exécutant la commande indiquée. Après avoir cliqué sur Extraction de particules, dans l’onglet E/S, entrez les micrographies et les coordonnées corrigées du CTF.
Cliquez ensuite sur l’onglet d’extraction, modifiez la taille de la boîte de particules à 300 pixels et exécutez le travail. Pour affiner la 3D, utilisez la carte générée dans CryoSPARC v3 comme modèle initial dans RELION-3. Sélectionnez la méthode d’importation et définissez les paramètres indiqués dans l’onglet E/S.
Ensuite, dans l’onglet Autres, sélectionnez la carte CryoSPARC v3 comme fichier d’entrée, remplacez le type de nœud par référence 3D et exécutez la tâche. Ensuite, sélectionnez l’affinement automatique 3D et, sous l’onglet E/S, définissez les images d’entrée comme particules. star de la dernière tâche de sélection.
Utilisez la reconstruction CryoSPARC v3 comme carte de référence, cliquez sur l’onglet de référence et changez le filtre passe-bas initial en 50 angströms et la symétrie en icosaèdre. Ensuite, dans l’onglet Optimisation, modifiez le diamètre du masque à 280 angstroms et exécutez la tâche. Pour le post-traitement, cliquez sur post-traitement.
Et dans l’onglet E/S, entrez les demi-cartes et le masque créés et définissez la taille de pixel calibrée sur 1,045 angstroms. Ensuite, dans l’onglet sharpen, pour estimer automatiquement le facteur B, entrez oui. Pour la résolution la plus basse pour l’ajustement auto-B, entrez 10.
Et pour utiliser votre propre facteur B, entrez no. Enfin, sous l’onglet Filtre, définissez ignorer la pondération FSC sur non et exécutez la tâche. Pour la formation au polissage, ouvrez le polissage bayésien.
Et sous l’onglet E/S, entrez les micrographies corrigées du mouvement, les particules et PostProcess. fichier étoile obtenu précédemment. Cliquez sur l’onglet d’entraînement et définissez les paramètres optimaux de train sur oui, fraction de pixels de Fourier pour le test à 0,5 et utilisez autant de particules à 5 000.
Exécutez ensuite la tâche. Une fois le travail de formation terminé, cliquez sur Polissage bayésien. Ensuite, dans l’onglet d’entraînement, définissez les paramètres optimaux du train sur no.
Sélectionnez l’onglet polissage et, dans le fichier de paramètres optimisé, spécifiez le chemin d’accès au opt_params_all_groups. txt de l’étape précédente et cliquez sur exécuter. Pour estimer les aberrations d’ordre supérieur, ouvrez le raffinement CTF.
Et dans l’onglet E/S sous particules, sélectionnez le chemin d’accès au fichier étoile contenant des particules polies de la récente tâche 3D affinée. Ensuite, sous le fichier STAR de post-traitement, définissez le chemin d’accès à la sortie de la dernière tâche de post-traitement. Ensuite, sélectionnez l’onglet d’ajustement et définissez le grossissement anisotrope de l’estimation sur no.
Effectuez l’ajustement des paramètres CTF sur no. Estimer beamtilt à oui. Estimez également le trèfle à oui.
Et estimer les aberrations du quatrième ordre à oui. Exécutez ensuite la tâche. Pour affiner et valider davantage la carte RELION-3, lancez Scipion 3 et créez un nouveau projet.
Dans le panneau des protocoles de gauche, sélectionnez le menu déroulant Importations et cliquez sur Importer des particules. Modifiez l’importation des paramètres de RELION-3 et le fichier étoile en postprocess.star. Spécifiez ensuite les paramètres d’acquisition comme illustré précédemment et cliquez sur exécuter.
Ensuite, cliquez sur le menu déroulant des importations et sélectionnez les volumes d’importation. Sous Importer de, donnez le chemin d’accès à la carte RELION-3, modifiez le taux d’échantillonnage de la taille des pixels à 1,045 angstroms par pixel et exécutez. Pour effectuer un alignement global, sélectionnez le menu déroulant Affiner dans le panneau protocoles et cliquez sur xmipp3-highres.
Entrez les particules et les volumes importés des étapes précédentes en tant qu’images en taille réelle et volumes initiaux respectivement et définissez le groupe de symétrie sur icosaédrique. Ensuite, dans l’onglet Alignement de l’image sous affectation angulaire, choisissez global, définissez la résolution cible maximale sur trois angstroms et exécutez la tâche. Pour effectuer un alignement local, sélectionnez xmipp3-highres global, passez de l’exécution précédente à yes et sélectionnez la tâche précédente.
Ensuite, dans l’onglet Affectation angulaire, modifiez l’alignement de l’image en local et définissez la résolution cible maximale sur 2,1 angströms. Une fois terminé, dans la fenêtre de résultats xmipp3-highres, cliquez sur les tracés de résolution d’affichage pour voir comment le FSC a changé après l’affinement et cliquez sur l’histogramme de tracé avec des modifications angulaires pour voir si les affectations d’angle d’Euler ont changé. Inspectez le volume dans UCSF Chimera.
Effectuez un zoom avant et recherchez des fonctionnalités haute résolution. Les micrographies présentant un bon ajustement au CTF et un faible astigmatisme ont été sélectionnées pour un traitement ultérieur, tandis que celles présentant un astigmatisme élevé et une perte ont été rejetées. Les moyennes de classe 2D contenant des classes bien définies ont été sélectionnées et celles avec une faible résolution, du bruit et des particules partielles ont été rejetées.
Les régions de la carte de cryo-microscopie électronique équipées des coordonnées atomiques d’un virus adéno-associé sont montrées ici. Des densités EM bien définies permettent d’ajuster des chaînes latérales d’acides aminés individuels, de molécules d’eau et d’ions magnésium. Les courbes FSC calculées à l’aide de CryoSPARC v3, RELION-3 et Scipion indiquent une résolution croissante dans l’ensemble du flux de travail, des estimations de résolution à quatre tranches différentes à travers les structures et des histogrammes de résolution démontrent l’amélioration incrémentielle de la résolution locale entre les cartes tout au long du flux de travail.
La combinaison des algorithmes de traitement cryo-EM de CryoSPARC, RELION-3, Scipion et Phoenix a entraîné une augmentation de la résolution des structures virales adéno-associées de 2,9 à 2,3 angströms dans le pipeline de traitement. Il est important de se rappeler que les paramètres spécifiés à chaque étape dépendent de l’échantillon et du microscope. De plus, la capacité d’atteindre une haute résolution dépend grandement de la qualité de l’échantillon et des données brutes.
Dans cette vidéo, nous présentons le flux de travail SP robuste pour le traitement des données cryo-EM sur diverses plates-formes logicielles. En utilisant cette approche, on peut implémenter des algorithmes pour plusieurs programmes afin d’affiner et de valider les structures cryogéniques. Ce flux de travail peut être appliqué aux calculs de structure d’une grande variété d’assemblages macromoléculaires.
