Avec environ 100 millions de cellules dans le cerveau de la souris et des tailles d’images de résolution cellulaire du cerveau entier approchant l’échelle du téraoctet, des outils avancés d’analyse d’images sont nécessaires pour quantifier avec précision les cellules. Notre pipeline de calcul peut prétraiter les images et quantifier les noyaux dans le cortex de la souris tout en maintenant un compromis raisonnable entre la précision de détection des cellules, le temps d’imagerie et les ressources de calcul. Felix Kyere et Ian Curtin, étudiants diplômés de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.
Pour commencer, montez l’échantillon dans le porte-échantillon de taille d’échantillon approprié de sorte que l’échantillon soit orienté avec la dimension z ne dépassant pas 5,2 millimètres de profondeur en raison de la distance de travail nominale du microscope UltraMicroscope II. Insérez ensuite le support dans le socle d’échantillon de telle sorte que la vis du support soit inclinée de 45 degrés par rapport aux supports du berceau. Ensuite, placez le berceau dans une position telle que l’échantillon soit orienté perpendiculairement au trajet de la lumière.
Ensuite, réglez le corps du zoom sur le microscope sur un grossissement 4x ou supérieur, ce qui donne 0,75 micromètre par pixel. Dans le logiciel Inspector Pro, sélectionnez une seule feuille lumineuse avec une valeur d’ouverture numérique d’environ 0,08. Pour vous assurer que la résolution axiale est maintenue sur toute la largeur de l’image, sélectionnez Mise au point dynamique horizontale et appliquez le nombre d’étapes recommandé en fonction de la longueur d’onde laser.
Ajustez ensuite la mise au point fine pour chaque canal par rapport au canal d’enregistrement et la puissance laser par canal par rapport aux propriétés du canal. Ensuite, réglez la largeur de la feuille de lumière à environ 50% pour vous assurer que la puissance de la feuille est répartie de manière optimale dans la dimension y pour la taille de l’échantillon. Ensuite, définissez le nombre de tuiles par rapport à la taille de l’échantillon avec un chevauchement recommandé de 15 % entre les tuiles, et capturez des images pour chaque canal séquentiellement pour chaque pile à une position de tuile donnée.
Tout d’abord, téléchargez et installez le gestionnaire d’environnement Conda pour les outils de traitement d’image Linux et NuMorph. Sur la ligne de commande, exécutez matlab et NM_setup. m de NuMorph pour télécharger et installer les logiciels d’analyse d’images nécessaires à l’analyse.
Spécifiez ensuite les noms d’échantillons, les répertoires d’entrée et de sortie, les informations sur les canaux et les paramètres d’imagerie de feuille de lumière en modifiant le fichier NM_samples.m. Pour le réglage de l’intensité, dans NMp_template, définissez intense le réglage sur true et use_processed_images comme false lorsque vous travaillez avec un nouvel ensemble d’images. Ensuite, définissez save_images et save_samples comme vrai.
Ensuite, définissez l’ombrage des tuiles sur de base pour appliquer la correction de l’ombrage à l’aide de l’algorithme de base, ou manuellement pour appliquer la correction de l’ombrage des tuiles à l’aide des mesures de l’UltraMicroscope II à des largeurs de feuille de lumière spécifiques. Pour l’alignement des canaux d’image, dans NMp_template, définissez channel_alignment sur true et canalisez alignment_method sur translation ou elastics. Ensuite, définissez sift_refinement comme true et la valeur de chevauchement de 0,15 pour faire correspondre les chevauchements de tuiles pendant la création d’images.
Pour exécuter les étapes de prétraitement dans MATLAB, spécifiez le nom de l’exemple et définissez la configuration sur NM_config exemple de processus. Exécutez ensuite l’une des étapes de prétraitement en spécifiant NM_process point de configuration tout en spécifiant l’étape à l’aide de l’intensité, de l’alignement ou du point, et recherchez dans le répertoire de sortie les fichiers de sortie pour chacune des étapes. Commencez avec une image Atlas 3D et une image d’annotation associée qui attribue chaque voxel à une structure particulière.
Alignez l’image Atlas et le fichier d’annotation pour vous assurer qu’ils correspondent correctement dans la bonne orientation. Après l’alignement, traitez les fichiers dans NuMorph pour spécifier les entrées comme décrit dans le manuscrit en exécutant la commande. Dans NMa_template, définissez resample_images sur true et resample_resolution pour qu’il corresponde à l’Atlas.
Spécifiez ensuite le numéro de canal à rééchantillonner à l’aide de resample_channels. Ensuite, définissez register_images sur true, spécifiez le atlas_file correspondant au fichier dans le répertoire Atlas et définissez-registration_parameters par défaut. Définissez ensuite save_registered_images sur true.
Pour la détection des noyaux, le comptage des cellules et la classification, définissez à la fois count_nuclei et classify_cells comme vrais. Définissez ensuite le count_method sur 3dunet et min_intensity pour définir un seuil d’intensité minimum pour les objets détectés. Ensuite, réglez classify_method sur l’un ou l’autre seuil qui est basé sur une intensité de fluorescence non supervisée aux positions centroïdes, ou SVM qui modélise un classificateur de machine à vecteur de support linéaire supervisé.
Pour effectuer des étapes d’analyse dans MATLAB, spécifiez le nom de l’échantillon et définissez la configuration pour NM_config analyser l’exemple. Ensuite, exécutez l’une des étapes d’analyse en spécifiant NM_analyze étape de configuration tout en spécifiant l’étape à l’aide de rééchantillonner, enregistrer, compter ou classer et vérifiez le répertoire de sortie pour les fichiers de sortie pour chacune des étapes. Dans NMe_template, définissez update sur true et compare_structures_by sur l’un ou l’autre index.
Définissez ensuite le fichier modèle et la table de structure qui spécifie tous les index de structure et structures possibles à évaluer tout en spécifiant le comptage de cellules et la classification du type de cellule. Le nettoyage des tissus à l’aide du protocole iDISCO+ et des marqueurs de noyaux spécifiques à la couche neuronale a permis d’obtenir des groupes cellulaires clairement définis de neurones des couches supérieure et inférieure dans l’isocortex. Le comptage des cellules à l’aide de NuMorph dépendait de la réussite des étapes de prétraitement impliquant le réglage de l’intensité, l’alignement des canaux et l’assemblage.
Cependant, des erreurs dans les étapes de prétraitement peuvent entraîner un assemblage incorrect, entraînant un alignement et un assemblage incorrects, et donc entraîner des images avec un motif flou et flou. Afin de compter les noyaux de régions cérébrales spécifiques, les images assemblées seront annotées à l’aide d’Atlas, ce qui permettra de superposer des annotations sur les régions du cerveau. Les centroïdes des noyaux ont été détectés avec un modèle U-Net 3D entraîné dans NuMorph avec environ 12 millions de noyaux totaux qui étaient TO-PRO-3-positifs dans l’isocortex avec environ 2,6 millions de noyaux cerveau-deux positifs et 1,6 million CTIP2-positifs.
Environ 3,7 et 2,9 millions de noyaux totaux TO-PRO-3-positifs dans les noyaux gris centraux et l’allocortex hippocampique ont été détectés, respectivement. Cependant, les cellules cérébrales à deux positifs détectées dans ces deux régions du cerveau étaient négligeables, et seulement environ 1,5 dans moins d’un million de cellules CTIP2 positives ont été détectées chacune dans les noyaux gris centraux et l’allocortex hippocampique. Effectuez des contrôles de qualité visuelle lors de l’acquisition pour obtenir une bonne segmentation.
Et configurez correctement l’environnement Conda pour vous assurer qu’aucune erreur n’est rencontrée dans une analyse en aval. En plus du comptage cellulaire, ce pipeline permet l’intégration avec d’autres outils de segmentation qui mesurent la taille et la forme des cellules, ce qui peut ensuite être comparé entre les groupes de génotypes. Grâce à notre pipeline, nous pouvons identifier comment l’anatomie du cerveau change à la résolution cellulaire, ce qui conduit à l’identification des types de cellules et des régions cérébrales importantes pour le risque de maladie.
