Notre protocole est convivial. En utilisant cette technique, n’importe qui peut facilement isoler le composant du sang. La contamination peut être minimisée et les matériaux peuvent être séparés avec précision.
Grâce à l’automatisation et à l’établissement de ce protocole, les chercheurs peuvent facilement obtenir des substances liées au cancer de haute pureté, ce qui est utile pour diverses études en aval. En particulier, il devrait offrir des avantages importants pour la recherche sur les utilisateurs finaux. Jay Jeong, chercheur principal et directeur adjoint à l’Institut de recherche en génomique du cancer, fera la démonstration de leur procédure.
Pour commencer, chargez la cartouche LBx 1 en sélectionnant le type de cartouche sur l’écran tactile de l’instrument. Appuyez sur le bouton fléché pour modifier le nombre d’échantillons. Ensuite, ouvrez la porte de l’instrument et insérez toutes les cartouches à utiliser dans l’ordre du numéro sur le porte-cartouche.
Pour un total de quatre cartouches, placez la cartouche factice dans l’espace vide du porte-cartouche. Utilisez la molette de support pour monter la cartouche et serrez l’écrou de verrouillage pour la fixer. Fermez la porte et appuyez sur le bouton Exécuter de l’écran du pavé tactile.
L’instrument ferme les vannes sur les cartouches, ce qui prend environ 30 secondes. Suivez le message pour ouvrir la porte. Retirez la roue de support et retirez la cartouche fermée par valve du porte-cartouche.
Pipeter un maximum de 10 millilitres d’un échantillon de sang total à l’aide d’une pipette sérologique. Insérez l’embout de la pipette profondément dans l’entrée de l’échantillon de la cartouche et injectez lentement l’échantillon de sang total. Après avoir inséré les cartouches dans l’instrument, fermez la porte de l’instrument et appuyez sur le bouton OK.
Le plasma et les couches leucocytaires sont automatiquement séparés du sang total, ce qui prend environ 30 minutes. Une fois le plasma et le pelage leucocytaire séparés, un message à l’écran accompagné d’un son d’alarme apparaîtra. Arrêtez l’alarme en ouvrant la porte ou en appuyant sur le bouton d’arrêt.
Ouvre la porte. Retirez la cartouche et placez-la sur la table. Récupérez trois millilitres de plasma de la sortie de plasma à l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre.
Ensuite, récupérez trois millilitres de la couche leucocytaire de la sortie de la couche leucocytaire à l’aide d’un embout de pipette d’un millilitre. Ensuite, chargez la cartouche LBx 2 en sélectionnant le nom de la cartouche sur l’écran tactile de l’instrument. Appuyez sur le bouton fléché pour modifier le nombre d’échantillons et suivez la même procédure que celle indiquée pour la cartouche LBx 1 pour insérer la cartouche dans le porte-cartouche.
Après avoir inséré la cartouche et fermé la porte, appuyez sur le bouton de fonctionnement de l’écran du pavé tactile. Suivez la procédure décrite précédemment pour retirer la cartouche fermée par valve du porte-cartouche et la placer sur la table. Pipeter la solution de gradient de densité à l’aide d’une pipette sérologique.
Insérez l’embout de la pipette profondément dans l’entrée de la cartouche et injectez lentement la solution. Ensuite, pipeter l’échantillon de sang total et l’injecter lentement dans l’entrée de l’échantillon. Après avoir inséré et fixé la cartouche, fermez la porte et appuyez sur le bouton OK.
Une fois que le plasma et la PBMC sont automatiquement séparés du sang total, un message accompagné d’un son d’alarme apparaîtra. Ouvrez la porte et retirez la cartouche. Récupérez trois millilitres de plasma de la sortie de plasma à l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre, puis récupérez trois millilitres de PBMC de la sortie PBMC.
De même, pour la cartouche FAST-auto, après avoir retiré la cartouche fermée par valve du porte-cartouche, injectez six millilitres de la solution PBS dans l’entrée PBS de la cartouche. Ensuite, pipeter trois millilitres de sang total ou de couche leucocytaire obtenue à partir de LBx 1, ou échantillon PBMC obtenu à partir de LBx 2, et injecter lentement l’échantillon dans l’entrée de l’échantillon de la cartouche. Après avoir inséré la cartouche et l’avoir fixée, fermez la porte et appuyez sur le bouton OK.
Une fois l’enrichissement automatique des CTC terminé, arrêtez l’alarme. Retirez la cartouche et insérez le dissolvant de plaque arrière, ou BPR, dans les quatre trous situés à l’avant de la cartouche. Appuyez sur l’aile bleu foncé avec les pouces des deux mains, puis appuyez sur le corps bleu clair jusqu’à ce qu’il clique.
Retirez délicatement le corps de la cartouche en le soulevant. Très doucement, ramassez la membrane filtrante par le bord à l’aide d’une pince à épiler et placez la membrane dans un tube de 1,5 millilitre pour la préparation des acides nucléiques, ou sur un verre coulissant pour la coloration. Si nécessaire, récupérez le sang filtré à la sortie de sang à l’aide d’un millilitre d’embout de pipette.
Les cfDNA extraits ont été évalués à l’aide d’un bioanalyseur, et des bandes d’écran cfDNA ont été utilisées avec une échelle électronique. La ligne verte a été utilisée pour aligner l’échelle et l’échantillon. Les marques triangulaires indiquent la bande d’ADN.
La plupart des cfDNA ont une longueur de 166 paires de bases et certaines existent en multiples entiers de longueur. Habituellement, la concentration d’ADNcf mesure jusqu’à la taille de 50 à 700 paires de bases. Bien qu’il y ait une différence dans la quantité obtenue à partir de chaque échantillon individuel, comme 8,47 nanogrammes par millilitre et 5,2 nanogrammes par millilitre, les résultats de l’extraction cfDNA étaient bons à la fois pour la concentration et la distribution de taille dans tous les cas.
Ces résultats indiquent que la méthode LBx 1 sépare avec précision le plasma contenant de l’ADNcf. Dans FAST-auto, la membrane a été retirée et colorée avec des anticorps fluorescents pour détecter les CTC et les globules blancs. La membrane colorée, placée sur des lames de verre, a été observée au microscope à fluorescence.
Après la coloration membranaire, les cellules affichent les signaux DAPI ou nucléaires positifs en bleu, tandis que les EpCAM et les CK ou CTC positifs sont surlignés en vert, et les CD45 ou WBC positifs sont surlignés en rouge. Il n’est pas difficile d’enlever la membrane. Cependant, il est nécessaire de faire attention à la perte et à la contamination des CTC.
Sang total, PBMC et pelage buffy sont tous disponibles. Au lieu de cela, il vous suffit de définir le volume entier. D’autres liquides peuvent également être utilisés, bien que des tests soient nécessaires.
Cette technique peut être utilisée directement dans les hôpitaux et la substance peut être obtenue rapidement.
