Ce travail a été soutenu par des subventions de l&#39;Institut ontarien de recherche sur le cancer (# 08NOV230), la Fondation canadienne pour l&#39;innovation (# 13199), Cancer de la Prostate Canada, Janssen-oncologie, le London Regional Cancer Program, et le soutien des bailleurs de fonds de John et Donna Bristol grâce la London Health Sciences Foundation (ALA). LIE est soutenu par une Frederick Banting et Charles Best canadienne des bourses d&#39;études supérieures au doctorat. ALA est soutenu par une bourse de nouveau chercheur des IRSC et une bourse de nouveau chercheur du ministère de la Recherche et de l&#39;Innovation de l&#39;Ontario.

Toutes les études humaines décrites dans ce manuscrit ont été réalisées selon des protocoles approuvés par le Comité d&#39;éthique de la recherche humaine de l&#39;Université Western. Toutes les études sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les recommandations du Conseil canadien de protection des animaux, selon des protocoles approuvés par le Sous-Comité d&#39;utilisation des animaux de l&#39;Université Western. Une. Norme CTC énumération des échantillons de sang de patients avec des CSS Une. Sang humain Collection et préparation des échantillons pour le traitement de l&#39;instrument Préparation <ol><li> En utilisant des techniques de saignée d&#39;asepsie standard, tirer un minimum de 8,0 ml de sang humain dans un tube de 10 ml de CellSave (ci-après dénommé le tube de conservation CTC), qui contient de l&#39;acide éthylène diamine (EDTA) et un conservateur cellulaire propriétaire. Inversez les 5x tube pour empêcher le sang de coaguler. Les échantillons peuvent être traités immédiatement ou conservés à température ambiante pendant jusqu&#39;à 96 heures. </li><li> REMOVréactifs e CSS du réfrigérateur et les laisser se réchauffer à température ambiante avant de l&#39;utiliser. </li><li> Utilisation d&#39;une pipette jetable de 10 ml et pipette automatisée, collecter 7,5 ml de sang à partir du tube d&#39;agent de conservation et distribuer CTC lentement sang dans un tube d&#39;instrument préparation transformation marquée de manière appropriée. </li><li> Ajouter 6,5 ml de tampon de dilution de chaque échantillon. Mélanger en retournant échantillon 5x. Extrait Centrifugeuse à 800 g pendant 10 min avec le frein en position &quot;off&quot;. Suivez les instructions à l&#39;écran sur l&#39;instrument de préparation pour charger tous les échantillons de patients dans le système de traitement. Les échantillons doivent être traitées dans les 1 heure de préparation. </li></ol> 2. Préparation de contrôle pour le traitement de l&#39;instrument Préparation <ol><li> Vortex doucement le flacon de contrôle et inverser 5x pour mélanger. </li><li> Retirer le bouchon du flacon de contrôle et placer une préparation instrument tube de traitement inversé sur le dessus du flacon non bouché. Dans un mouvement rapide, inverser lacontrôler flacon, et verser le contenu dans le tube de traitement. Tandis inversé, effleurer doucement les côtés du flacon de commande pour libérer le contenu restant. </li><li> Retirez délicatement le flacon de contrôle inversée à partir du tube de traitement, en veillant à ce qu&#39;aucun liquide est perdu et mettre de côté. En utilisant une pipette de 1000 ul, recueillir le contenu restant de la cuvette et le couvercle et la pipette doucement dans le tube de traitement. </li><li> Suivez les instructions à l&#39;écran sur l&#39;instrument de préparation à charger le contrôle sur le système de traitement. </li></ol> 3. Numérisation de l&#39;échantillon sur l&#39;instrument d&#39;analyse <ol><li> Suivez les instructions à l&#39;écran sur l&#39;instrument de préparation pour décharger tous les échantillons du système. Librement plafonner chaque cartouche de dispositif magnétique et appuyez sur l&#39;appareil magnétique à l&#39;aide des mains ou paillasse pour libérer les bulles qui sont collées sur les bords de la cartouche. Une fois toutes les bulles ont été enlevés, Cap fermement la cartouche, mets le dispositif magnétique plat, et incubate dans l&#39;obscurité pendant au moins 20 min à température ambiante. Les échantillons doivent être analysés dans les 24 heures de préparation. </li><li> Allumer l&#39;instrument d&#39;analyse et d&#39;initialiser la lampe. Une fois réchauffé (~ 15 min), de charger la cartouche de vérification du système sur l&#39;instrument d&#39;analyse et sélectionnez l&#39;onglet Test QC. Suivez les instructions à l&#39;écran pour effectuer les mesures de contrôle de qualité nécessaires. </li><li> Chargez un échantillon sur l&#39;instrument d&#39;analyse et sélectionnez l&#39;onglet Test patients. Toutes les informations enregistrées par l&#39;instrument de préparation sera affiché. Cliquez sur Démarrer pour initialiser la numérisation de l&#39;échantillon. Le système effectue une mise au point rapide et la détection de bord sur la cartouche de dispositif magnétique. </li><li> Réglez tous les bords que nécessaire en utilisant les touches directionnelles. Sélectionnez Accepter. Le système effectue une mise au point fine et commencer la numérisation de l&#39;échantillon. </li><li> Après contrôle la numérisation des résultats devrait être validée en utilisant les critères définis pour les cellules enrichis à haute (CK + DAPI + CD45 - APC +) et bas (CK + DAPI + CD45 - FITC +) des concentrations. Après échantillon de patient balayage des résultats devrait être revu pour CTC capturées en utilisant les critères définis CCT (CK + DAPI + CD45 -). </li></ol> 2. Caractérisation de la CCT pour les marqueurs définis par l&#39;utilisateur en utilisant le CSS Une. Préparation des marqueurs définis par l&#39;utilisateur et l&#39;instrument d&#39;initialisation <ol><li> Diluer l&#39;anticorps d&#39;intérêt en utilisant Bond Anticorps primaire diluant à la concentration désirée dans une cuvette de réactif de marquage à l&#39;aide de la formule suivante, où la concentration de travail est la concentration de l&#39;anticorps après addition de l&#39;échantillon et la concentration des stocks est la concentration d&#39;anticorps dans l&#39; réactif tasse. Pour de multiples échantillons, ajuster les volumes anticorps tels que décrits dans le Tableau 1. Placer la cuvette dans le réactif marqueur dans une position de la cartouche de réactif et lOad la cartouche sur CSS. Stock Concentration = (Concentration de travail x 850 pi) / 150 pi </li><li> Prélever le sang, la préparation des échantillons, et charger l&#39;instrument de préparation comme décrit dans la norme ci-dessus CTC énumération des échantillons de sang des patients utilisant le protocole de CSS. Pour permettre plus de marqueur personnalisé, sélectionnez Défini par l&#39;utilisateur test lorsque vous êtes invité par l&#39;instrument de préparation. Entrez le nom du marqueur et sélectionnez Enregistrer. Comme les échantillons sont chargés sur l&#39;instrument, l&#39;opérateur sera invité à indiquer qui doit recevoir marqueur personnalisé en sélectionnant Oui ou Non, si nécessaire. </li></ol> 2. Numérisation de l&#39;échantillon de marqueurs définis par l&#39;utilisateur sur l&#39;instrument d&#39;analyse <ol><li> Allumez l&#39;instrument d&#39;analyse, initialiser la lampe, et effectuer un contrôle de la qualité et de la vérification du système comme décrit dans la section 3.2 de la Norme CTC énumération des échantillons de sang des patients utilisant le CSS </strong&gt; protocole. </li><li> Chargez un échantillon sur l&#39;instrument d&#39;analyse et sélectionnez l&#39;onglet Configuration. Pour initialiser le canal FITC, sélectionnez CellSearch CTC comme l&#39;ID du kit dans la section Protocoles de test. Dans ce menu, sélectionnez recherche de la CCT, cliquez sur le bouton Modifier et définir le temps d&#39;exposition souhaitée. Il est recommandé une durée d&#39;exposition de 1,0 sec pas être dépassée lors de l&#39;utilisation du kit CSS CTC car cela peut augmenter purge par d&#39;autres canaux fluorescents utilisés pour l&#39;identification de la CCT. </li></ol> 3. Adaptation de la CSSProtocol standard pour une utilisation dans des modèles précliniques de souris ** Adapté de Veridex souris / rat CellCapture Kit (n&#39;est plus disponible dans le commerce) Une. Souris de prélèvement sanguin et de stockage <ol><li> Avant la collecte de sang, entrent ~ 30 ul d&#39;EDTA 0,5 M et-vient à travers une aiguille 22 G, en laissant une petite quantité d&#39;EDTA dans le moyeu. </li><li>Recueillir un minimum de 50 pi de sang de souris de souris préalablement injectées avec des cellules tumorales humaines par des voies orthotopiques, veine de la queue, ou intracardiaque. Prélever le sang de la veine saphène (pour l&#39;analyse de série CTC) ou par ponction cardiaque (pour l&#39;analyse borne CTC). Retirer l&#39;aiguille et distribuer le sang dans un tube EDTA Microtainer collecte de sang de 1 ml. Mélanger par inversion ou le tube doucement film pour empêcher le sang de coaguler. Le sang peut être traité immédiatement ou conservé à la température ambiante pendant jusqu&#39;à 48 heures après l&#39;addition d&#39;un volume égal de CytoChex conservateur cellulaire. </li></ol> 2. CTC enrichissement <ol><li> Retirer réactifs CSS du réfrigérateur et laissez-les se réchauffer à température ambiante avant de l&#39;utiliser. </li><li> Transférer l&#39;équivalent de 50 ul de sang entier à un débit de 12 mm x 75 mm cytométrie tube. Ajouter 500 pi de tampon de dilution de chaque échantillon, en faisant descendre le sang qui reste sur les parois du tube. Si nécessaire, une rotation de la centrifugeuse à courtpeut être utilisé pour recueillir du sang restant. </li><li> Vortexer doucement le ferrofluide anti-EpCAM et ajouter 25 ul de chaque échantillon en plaçant la pointe de la pipette directement dans l&#39;échantillon. Ajouter 25 ul de réactif de capture d&#39;amélioration et vortex doucement pour mélanger. Incuber les échantillons à la température ambiante pendant 15 min. </li><li> Placer les tubes échantillons dans l&#39;aimant et incuber pendant 10 min. Alors que les tubes d&#39;échantillons sont encore en l&#39;aimant, utiliser une pipette en verre pour aspirer délicatement le liquide résiduel sans toucher la paroi du tube à côté de l&#39;aimant et le jeter. </li></ol> 3. CTC coloration <ol><li> Retirer les tubes d&#39;échantillon à partir de l&#39;aimant et remettre en suspension dans 50 pl d&#39;acide nucléique de colorant, 50 ul de réactif de coloration, 1,5 ul d&#39;anticorps anti-souris CD45-APC, 5,0 ul d&#39;anticorps anti-humain HLA-Alexa Fluor 488, et 100 ul de perméabilisation Réactif. Pour de multiples échantillons, ces réactifs peuvent être prémélangés et 206,5 pi de mélange peuvent être ajoutés à chaque tube. Vortex doucement pour mélangeret incuber pendant 20 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Ajouter 500 ul de tampon de dilution, vortex doucement, tubes lieu de l&#39;échantillon dans l&#39;aimant, et incuber pendant 10 min. Alors que les tubes d&#39;échantillons sont encore en l&#39;aimant, utiliser une pipette en verre pour aspirer délicatement le liquide résiduel sans toucher la paroi du tube à côté de l&#39;aimant et le jeter. Retirer les tubes d&#39;échantillon à partir de l&#39;aimant et remettre en suspension dans 350 ul de tampon de dilution. Vortex légèrement pour bien mélanger. </li></ol> 4. Dispositif magnétique Chargement en cours <ol><li> En utilisant une pointe de charge de gel, transfert soigneusement la totalité du volume du tube à échantillon dans une cartouche dans le dispositif magnétique. Commencez par le bas de la cartouche et retirer lentement la pointe de l&#39;échantillon est distribué. </li><li> Une fois l&#39;ensemble de l&#39;échantillon a été transféré, le capuchon lâche la cartouche de dispositif magnétique et appuyez sur l&#39;appareil magnétique à l&#39;aide des mains ou paillasse pour libérer les bulles qui sont collées sur les bords de la cartouche comme décrit dans Section 3.1 de la Norme CTC énumération des échantillons de sang des patients utilisant le CSS. </li><li> Pop toutes les bulles en utilisant une aiguille 22 G stérile en les piégeant entre le biseau et le bord de la cartouche. Une fois toutes les bulles ont été enlevés, plafonner fermement la cartouche, fixer le dispositif magnétique plat, et incuber à l&#39;obscurité pendant au moins 10 min. Les échantillons doivent être analysés dans les 24 heures de préparation. </li></ol> 5. Numérisation des échantillons manuellement séparés sur l&#39;instrument d&#39;analyse <ol><li> Allumez l&#39;instrument d&#39;analyse, initialiser la lampe, et effectuer un contrôle de la qualité et de la vérification du système comme décrit dans la section 3.2 de la Norme CTC énumération des échantillons de sang des patients utilisant le protocole de CSS. </li><li> Chargez l&#39;échantillon sur l&#39;instrument d&#39;analyse et sélectionnez l&#39;onglet Configuration. Effacer toutes les données existantes sur le bouton de données de dispositif magnétique en cliquant sur ​​le bouton Format de l&#39;échantillon. Activer le canal FITCe régler le temps d&#39;exposition à 1,0 sec, comme décrit à la section 2.2 de la caractérisation de la CCT pour les marqueurs définis par l&#39;utilisateur à l&#39;aide de la CSS. </li><li> Cliquez sur l&#39;onglet Test du patient et sélectionnez Modifier pour saisir l&#39;information échantillon. Sélectionnez CellSearch CTC comme ID Kit et recherche de la CCT que le protocole de test. Entrez les informations nécessaires restant comme indiqué que l&#39;astérisque. Sauvegarder l&#39;information échantillon et cliquez sur Démarrer. </li></ol>

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Cell. 14 (6), 818-829 (2008).</li><li>Gradilone, A., Raimondi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cells+lacking+cytokeratin+in+breast+cancer:+the+importance+of+being+mesenchymal.">Circulating tumour cells lacking cytokeratin in breast cancer: the importance of being mesenchymal.</a> J. Cell. Mol. Med. 15 (5), 1066-1070 (2011).</li><li>K&#246;nigsberg, R., Obermayr, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+EpCAM+positive+and+negative+circulating+tumor+cells+in+metastatic+breast+cancer+patients.">Detection of EpCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients.</a> Acta Oncol. 50 (5), 700-710 (2011).</li><li>Kasimir-Bauer, S., Hoffmann, O., Wallwiener, D., Kimmig, R., Fehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+stem+cell+and+epithelial-mesenchymal+transition+markers+in+primary+breast+cancer+patients+with+circulating+tumor+cells.">Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells.</a> Breast Cancer Res. 14 (1), (2012).</li><li>Mego, M., Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition-inducing+transcription+factors+in+primary+breast+cancer:+The+effect+of+neoadjuvant+therapy.">Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy.</a> Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).</li><li>Yu, M., Bardia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+breast+tumor+cells+exhibit+dynamic+changes+in+epithelial+and+mesenchymal+composition.">Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition.</a> Science. 339 (6119), 580-584 (2013).</li><li>Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+from+patients+with+advanced+prostate+and+breast+cancer+display+both+epithelial+and+mesenchymal+markers.">Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers.</a> Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).</li></ol>

L&#39;auteur (ALA) a reçu un financement qui a été fourni par Janssen oncologie, dont la société mère Johnson &amp; Johnson possède également Janssen Diagnostics LLC, qui produit des réactifs et des instruments utilisés dans cet article.

Malgré le développement de nombreuses technologies nouvelles de la CCT depuis l&#39;introduction de la CSS en 2004, cette technique est encore la seule technologie cliniquement approuvé sur le marché aujourd&#39;hui et il est donc considéré comme l&#39;étalon-or actuel pour la détection et le dénombrement de la CCT. Ce manuscrit a démontré que, bien que le CSS a des normes de contrôle de qualité rigoureuses, il peut être sujet à des biais d&#39;interprétation et que l&#39;identification de la CCT dans le...

En 2013, on estime que 580 350 personnes mourront du cancer et que 1.660.290 nouveaux cas de cette maladie sera diagnostiquée aux États-Unis seulement 1. La majorité de ces décès surviennent à la suite de l&#39;apparition de la maladie métastatique 2. L&#39;absence actuelle de traitements efficaces dans le traitement des métastases et une compréhension limitée de la cascade métastatique rend ce stade de la maladie souvent mortelle. La présence de cellules tumorales circulantes (CTC) dans le sang ont été démontrées en corrélation avec une maladie métastatique 3. Ces cellules sont extrêmement rares et leur détection est indicatif de la survie globale dans le sein métastatique 4, 5 prostate, colorectal et le cancer 6. Chez ces patients, la présence de ≥ 5 ≥ 3 (colorectal) CTC dans 7,5 ml de sang (sein et prostate) ou est indicatif de moins bon pronostic par rapport aux patients avec peu ou pas du CTC détectables dans le samle volume de courrier de sang. En outre, le changement du nombre de CTC pendant ou après une intervention thérapeutique a été démontrée comme étant utile en tant que prédicteur de la réponse au traitement, souvent plus rapidement que les techniques actuellement utilisées 7-10. Il a été estimé que, chez les patients atteints d&#39;un cancer métastatique, CTC se produisent à une fréquence d&#39;environ 1 CTC par 10 5 à 10 7 cellules mononucléées du sang et chez les patients présentant une maladie localisée, cette fréquence peut être encore plus faible (~ 1 à 10 8). La rareté de ces cellules, il peut être difficile à détecter avec précision et de manière fiable et analyser CTC 11. Plusieurs méthodes (examen préalable 12-14) ont été utilisées pour enrichir et de détecter ces cellules en exploitant les propriétés qui les différencient des environs composants sanguins. En général, la CCT énumération est un processus en deux parties qui nécessite à la fois une étape d&#39;enrichissement et une étape de détection. Traditionnellement, les étapes d&#39;enrichissement s&#39;appuient sur les différences dans l&#39;éducation physiqueques des propriétés CTC (taille des cellules, la densité, la déformabilité) ou sur l&#39;expression du marqueur de protéine (par exemple la molécule d&#39;adhésion des cellules épithéliales [EpCAM], de cytokératine [CK]). À la suite de l&#39;enrichissement, la détection de CTC peut être effectuée dans un certain nombre de façons différentes, dont les plus courantes sont les dosages à base d&#39;acide nucléique et / ou des méthodes de cytométrie. Chacune de ces stratégies sont uniques, présentant des avantages et des inconvénients distincts, mais ils manquent tous de normalisation; une nécessité pour l&#39;entrée dans le milieu clinique. Le système CellSearch (CSS) a donc été développé pour fournir une méthode normalisée pour la recherche et le dénombrement des CTC rares dans le sang humain en utilisant la microscopie par fluorescence et des techniques à base d&#39;anticorps 4-6. Cette plate-forme est actuellement considéré comme l&#39;étalon-or dans la CCT énumération et est la seule technique approuvé par la US Food and Drug Administration (FDA) pour une utilisation dans la clinique 15. Le CSS est une plate-forme à deux composants consisting de, (1) le système CellTracks AutoPrep (ci-après dénommé l&#39;instrument de préparation), qui automatise la préparation des échantillons de sang humain, et (2) la CellTracks Analyzer II (ci-après dénommé l&#39;instrument d&#39;analyse), qui numérise ces échantillons suivants préparation. Pour distinguer les CTC de leucocytes contaminants de l&#39;instrument de préparation emploie un anticorps médiée, l&#39;approche de séparation magnétique à base ferrofluide et différencié coloration fluorescente. Initialement, le système CTC étiquettes en utilisant des anticorps anti-EpCAM conjugués à des nanoparticules de fer. L&#39;échantillon est ensuite incubé dans un champ magnétique, et toutes les cellules non marquées sont aspirés. Cellules tumorales sélectionnées sont remises en suspension, et on les incube dans un colorant de fluorescence différentielle, constitué d&#39;anticorps marqués par fluorescence et un réactif de coloration nucléaire. Enfin, l&#39;échantillon est transféré à une cartouche magnétique, appelé magnest (ci-après dénommé le dispositif magnétique), et scanned en utilisant l&#39;instrument d&#39;analyse. L&#39;instrument d&#39;analyse est utilisé pour numériser les échantillons préparés en utilisant les filtres de fluorescence différents, chacun optimisé pour la particule fluorescente appropriée, en utilisant une lentille d&#39;objectif 10X. CTC sont identifiées comme des cellules qui sont liées par des anticorps anti-EpCAM, l&#39;anti-pan-CK-phycoérythrine (PE) (CK8, 18, et 19), et la coloration nucléaire 4 &#39;,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). A l&#39;inverse, les leucocytes contaminants sont identifiées comme des cellules qui sont liées par l&#39;anti-CD45-allophycocyanine (APC) et DAPI. À la suite de l&#39;analyse, les cellules tumorales possibles définis par l&#39;ordinateur sont présentées à l&#39;utilisateur. A partir de ces images, l&#39;utilisateur doit employer une analyse qualitative en utilisant les paramètres définis et coloration différentielle décrits ci-dessus afin de déterminer quels événements sont CTC. En plus de fournir une méthode standardisée de dénombrement CTC, le CSS permet la caractérisation moléculaire des CTC sur la base de marqueurs de protéines d&#39;intérêt. Cette interrogation cun être effectuée au niveau de la cellule, à l&#39;aide d&#39;un isothiocyanate de fluorescéine (FITC) canal de fluorescence n&#39;est pas nécessaire pour l&#39;identification de la CCT 16. Bien que cette plate-forme fournit la capacité pour la caractérisation moléculaire, le processus détaillé de développement de protocole et l&#39;optimisation n&#39;est pas bien définie. Trois marqueurs disponibles dans le commerce ont été mis au point par le fabricant pour l&#39;utilisation avec le CSS, incluant récepteur épidermique de facteur de croissance (EGFR), récepteur humain de croissance épidermique de facteur 2 (HER2), et le facteur de croissance analogue à l&#39;insuline 1 receptor (IGF-1R). analyse de HER2, en combinaison avec le CSS, a été utilisé par plusieurs groupes pour illustrer le potentiel pour la caractérisation de la CCT pour éclairer la prise de décision clinique et de modifier potentiellement des directives de traitement existantes. Par exemple, Fehm et al. 17 démontré que près d&#39;un tiers des patients atteints de cancer du sein avec des tumeurs HER2-primaire avait HER2 + CTC. En outre, Liu et al.18 récemment rapporté que jusqu&#39;à 50% des patients atteints de SA + cancer du sein métastatique HER2 n&#39;a pas eu + CTC. Herceptin, un récepteur HER2 interférer anticorps monoclonal démontré à bénéficier grandement les patients dont les tumeurs expriment des niveaux suffisants de HER2, est un traitement couramment utilisé pour les patients atteints de HER2 + tumeurs primaires 19-21. Cependant, ces études suggèrent que Herceptin peut être étant sous-utilisés de manière optimale et que la CCT caractérisation peut aider à prédire la réponse au traitement. En fin de compte, la caractérisation de la CCT peut avoir le potentiel d&#39;améliorer les soins personnalisé. Recherche de la CCT est unique en ce qu&#39;il a largement utilisé une approche chevet à paillasse. Cette méthode, contrairement paillasse au chevet du patient recherche, qui peut souvent prendre des années à l&#39;impact des soins aux patients, a permis CTC entrée rapide dans le cadre clinique. Toutefois, les médecins hésitent à utiliser les résultats de l&#39;analyse de la CCT dans le traitement des patients prise de décisionment en raison d&#39;un manque de compréhension de la biologie sous-jacente. Par conséquent modèles murins précliniques appropriées des techniques de métastases et d&#39;analyse complémentaire CTC doivent être utilisés afin d&#39;étudier ces questions en suspens. En général, il existe deux types de modèles précliniques utilisés pour étudier la cascade métastatique, (1) les modèles de métastase spontanée, qui permettent l&#39;étude de toutes les étapes de la cascade métastatique, et (2) des modèles de métastases expérimentales qui ne permettent l&#39;étude des étapes ultérieures du processus métastatique tels que extravasation et la formation secondaire de la tumeur 22. Des modèles de métastase spontanée, impliquent des injections de cellules tumorales dans des emplacements appropriés (par exemple orthotopique d&#39;injection de cellules de cancer de la prostate dans la prostate pour l&#39;étude du cancer de la prostate). Les cellules sont alors données de temps pour former des tumeurs primaires et des métastases spontanément à des sites secondaires, tels que l&#39;os, le poumon et les ganglions lymphatiques. Dansrevanche, les modèles de métastases expérimentales impliquent l&#39;injection directe de cellules tumorales dans la circulation sanguine (par exemple, via la veine caudale ou par injection intracardiaque de cellules cibles à des emplacements spécifiques) et donc sauter les étapes initiales de intravasation et la diffusion d&#39;organes secondaires 22. Jusqu&#39;à présent, la majorité de l&#39;analyse CTC in vivo des systèmes modèles a été réalisée en utilisant soit 23 ou adaptés techniques CCT basée sur les droits, sur la base de cytométrie (p. ex AdnaTest) 24. Bien qu&#39;utile, aucune de ces techniques reflètent adéquatement CTC énumération en utilisant le CSS de l&#39;étalon-or. Sur la base de l&#39;approbation clinique, la nature standardisée, et l&#39;utilisation généralisée de la CSS, le développement d&#39;une capture et la détection technique CTC pour la modélisation in vivo qui utilise la préparation de l&#39;échantillon équivalent, le traitement et les critères d&#39;identification serait avantageux que les résultats seraient comparables à ceux obtenu à partir d&#39;échantillons de patients. Toutefois, en raison de la req de volumeuirements de l&#39;instrument de préparation, il n&#39;est pas possible de traiter des petits volumes de sang à l&#39;aide de cette plate-forme automatisée. . Par ailleurs, des travaux antérieurs par Eliane et al 25 a démontré que la contamination des échantillons avec des cellules épithéliales de la souris (qui répondent aussi à la définition standard de la CCT [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -]) peut conduire à des erreurs de classification des cellules épithéliales squameuses de la souris comme CTC. Pour répondre à ces questions une technique adaptée qui permet l&#39;utilisation des réactifs du kit CSS CCT combinés avec un manuel de procédure d&#39;isolement a été développé. L&#39;addition d&#39;un antigène de leucocyte humain marqué au FITC (HLA) de l&#39;anticorps à l&#39;essai permet de cellules tumorales humaines pour les distinguer des cellules épithéliales squameuses de souris. Ce manuscrit décrit la norme, développée commercialement et protocole CSS optimisé pour le traitement des échantillons de sang des patients et les pièges courants qui peuvent être rencontrés, y compris discrepant des éléments qui peuvent conduire à des erreurs de classification de la CCT. Par ailleurs, la personnalisation de l&#39;essai de CSS pour examiner les caractéristiques de protéines définies par l&#39;utilisateur de CTC capturées et une technique comparable CSS adapté qui permet l&#39;enrichissement et la détection de CTC à partir de petits volumes de sang chez les souris modèles précliniques de métastase sont décrits.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">REAGENTS</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human CD44-FITC</td>
			<td style="width:175px;">BD Pharmigen&#160;</td>
			<td style="width:161px;">555478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human CD44-PE</td>
			<td style="width:175px;">BD Pharmigen&#160;</td>
			<td style="width:161px;">555479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human HLA-AlexaFluor488</td>
			<td style="width:175px;">BioLegend</td>
			<td style="width:161px;">311415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-mouse CD45-APC</td>
			<td style="width:175px;">eBioscience</td>
			<td style="width:161px;">17-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Bond Primary Antibody Diluent</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:161px;">AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:267px;">CellSave Preservative Tubes</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">952820 (20 pack)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 79100005 (100 pack)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CTC Control Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CTC Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CXC Control Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900018RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CXC Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900017RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Instrument Buffer</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7901003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Streck Cell Preservative (aka CytoChex)</td>
			<td style="width:175px;">Streck</td>
			<td>213350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">1 ml syringe</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">10 ml serological pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">1000&#181;l pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">1000&#181;l pipette tips</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">12 x 75mm flow tubes</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">200&#181;l gel loading tips</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">200&#181;l pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">22 gauge needle</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">5 3/4&#34; disposible pasteur pipet</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">5 ml serological pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Automated pipettor</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Capillary Blood Collection Tube (EDTA)</td>
			<td style="width:175px;">BD Microtainer</td>
			<td style="width:161px;">365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch Analyzer II</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">9555</td>
			<td rowspan="2" style="width:188px;">Includes magnests and verification cartirdges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">CellSearch AutoPrep System</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">9541</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">MagCellect Magnet&#160;</td>
			<td style="width:175px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:161px;">MAG997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Small Latex Bulb</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Vortex</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptation of semiautomated circulating tumor cell (ctc) assays for clinical and preclinical research applications

La majorité des décès liés au cancer surviennent à la suite de l&#39;apparition de la maladie métastatique. Ce stade de la maladie hautement létale est associée à la présence de cellules tumorales circulantes (CTC). Ces cellules rares ont été démontrés comme étant d&#39;importance clinique dans le sein métastatique, de la prostate et les cancers colorectaux. L&#39;étalon-or actuel dans la détection clinique de la CCT et le dénombrement est le système CellSearch approuvé par la FDA (CSS). Ce manuscrit décrit le protocole standard utilisé par cette plate-forme, ainsi que deux protocoles adaptés supplémentaires qui décrivent le processus détaillé de l&#39;optimisation de marqueur définie par l&#39;utilisateur pour la caractérisation des protéines de CTC patient et un protocole comparable pour CTC capture dans de très faibles volumes de sang, en utilisant la norme réactifs CSS, pour étudier dans des modèles murins précliniques in vivo de métastases. En outre, les différences de qualité entre les CTC sang de donneur sain dopés avec des cellules de culture de tissu par rapport à des patients samp de sangles sont mis en évidence. Enfin, plusieurs articles couramment discordants qui peuvent conduire à des erreurs de classification erronée de la CCT sont présentés. Pris ensemble, ces protocoles fourniront une ressource utile pour les utilisateurs de cette plate-forme intéressé dans la recherche préclinique et clinique relative à la métastase et CTC.

Norme CTC énumération Assay La sensibilité et la spécificité du CSS a été bien documenté dans la littérature. Toutefois, pour valider la récupération CTC équivalent, dopés (cellules de cancer de la prostate humain 1000 LNCaP) et non surchargés échantillons de sang humain provenant de donneurs volontaires en bonne santé ont été traitées sur le CSS en utilisant le protocole de CSSCTC standard. Comme prévu, les échantillons non dopés étaient libres de CTC, 0,00 ± 0,00%, et ...

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Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Cellules tumorales circulantes (CTC) sont pronostique dans plusieurs cancers métastatiques. Ce manuscrit décrit le système de l&#39;étalon-or CellSearch (CSS) CTC plate-forme d&#39;énumération et met en lumière les erreurs de classification communs. En outre, deux protocoles adaptés sont décrits pour défini par l&#39;utilisateur marqueur caractérisation des CTC et CTC énumération dans des modèles murins précliniques de métastases utilisant cette technologie.

Adaptation des semi-automatique de circulation des cellules tumorales (CTC) Essais pour les applications cliniques et précliniques de recherche

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

15.8K vues.  London Health Sciences Centre.  Cellules tumorales circulantes (CTC) sont pronostique dans plusieurs cancers métastatiques. Ce manuscrit décrit le système de l'étalon-or CellSearch (CSS) CTC plate-forme d'énumération et met en lumière les erreurs de classification communs. En outre, deux protocoles adaptés sont décrits pour défini par l'utilisateur marqueur caractérisation des CTC et CTC énumération dans des modèles murins précliniques de métastases utilisant cette technolog...

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Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Traitement des tissus de tumeur cérébrale primaire pour les essais sur les cellules souches et les flux de tri

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

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Médecine

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F IRM pour le suivi cellulaire

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

A Novel<em&gt; In vivo</em&gt; Technique Gene Transfer et<em&gt; In vitro</em&gt; Essais cellule sur la base de l&#39;étude de la perte osseuse dans les troubles musculo-squelettiques

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolement, cryoconservation et de la culture des droits de cellules épithéliales Amnion pour des applications cliniques

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both direct and rapid analysis of therapeutic sensitivity and resistance. However, recent evidence suggests that therapeutic response is not exclusive to the inherent molecular composition of cancer cells but rather is greatly influenced by the tumor cell microenvironment, a feature that cannot be recapitulated by traditional culturing methods. Even implementation of tumor xenografts, though providing a wealth of information on drug delivery/efficacy, cannot capture the tumor cell/microenvironment crosstalk (i.e., soluble factors) that occurs within human tumors and greatly impacts tumor response. To this extent, we have developed an ex vivo (fresh tissue sectioning) technique which allows for the direct assessment of treatment response for preclinical and clinical therapeutics development. This technique maintains tissue integrity and cellular architecture within the tumor cell/microenvironment context throughout treatment response providing a more precise means to assess drug efficacy.

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Established cancer cell lines and xenografts have been the mainstay of cancer research for the past several decades. However, recent evidence suggests that therapeutic response is greatly influenced by the tumor cell microenvironment. Therefore, we have developed an ex vivo analysis of primary tumor specimens for drug development purposes.

La réponse au traitement ex vivo de tumeurs primaires et / ou métastases associées préclinique et développement clinique de la thérapeutique

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

L&#39;isolement et la propagation des cellules tumorales circulantes d&#39;un cancer Modèle Souris

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Génération de cancer de la prostate des patients Dérivé modèles de xénogreffe de cellules tumorales circulantes

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Proton Therapy Delivery and Its Clinical Application in Select Solid Tumor Malignancies

Radiation therapy is a frequently used modality for the treatment of solid cancers. Although the mechanisms of cell kill are similar for all forms of radiation, the in vivo properties of photon and proton beams differ greatly and maybe exploited to optimize clinical outcomes. In particular, proton particles lose energy in a predictable manner as they pass through the body. This property is used clinically to control the depth at which the proton beam is terminated, and to limit radiation dose beyond the target region. This strategy can allow for substantial reductions in radiation dose to normal tissues located just beyond a tumor target. However, the degradation of proton energy in the body remains highly sensitive to tissue density. As a consequence, any changes in tissue density during the course of treatment may significantly alter proton dosimetry. Such changes may occur through alterations in body weight, respiration, or bowel filling/gas, and may result in unfavorable dose deposition. In this manuscript, we provide a detailed method for the delivery of proton therapy using both passive scatter and pencil beam scanning techniques for prostate cancer. Although the described procedure directly pertains to prostate cancer patients, the method may be adapted and applied for the treatment of virtually all solid tumors. Our aim is to equip readers with a better understanding of proton therapy delivery and outcomes in order to facilitate the appropriate integration of this modality during cancer therapy.

The fundamentals of radiation planning and delivery for proton therapy using prostate cancer as a model are presented. The application of these principles to other selected disease sites highlights how proton radiotherapy may enhance clinical outcomes for cancer patients.

Livraison de thérapie de proton et son Application clinique dans certains tumeurs solides malignes

Radiation therapy is a frequently used modality for the treatment of solid cancers. Although the mechanisms of cell kill are similar for all forms of ...

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity is disturbed in gastrointestinal, cardiovascular and metabolic diseases, which may result in easier access of biologically active compounds, such as gut bacterial metabolites, to the bloodstream. Thus, the permeability of the GBB may be a marker of both intestinal and extraintestinal diseases. Furthermore, the increased penetration of bacterial metabolites may affect the functioning of the entire organism.
Commonly used methods for studying the GBB permeability are performed ex vivo. The accuracy of those methods is limited, because the functioning of the GBB depends on intestinal blood flow. On the other hand, commonly used in vivo methods may be biased by liver and kidney performance, as those methods are based on evaluation of urine or/and peripheral blood concentrations of exogenous markers. Here, we present a direct measurement of GBB permeability in rats using an in vivo method based on portal blood sampling, which preserves intestinal blood flow and is virtually not affected by the liver and kidney function. 
Polyurethane catheters are inserted into the portal vein and inferior vena cava just above the hepatic veins confluence. Blood is sampled at baseline and after administration of a selected marker into a desired part of the gastrointestinal tract. Here, we present several applications of the method including (1) evaluation of the colon permeability to TMA, a gut bacterial metabolite, (2) evaluation of liver clearance of TMA, and (3) evaluation of a gut-portal blood-liver-peripheral blood pathway of gut bacteria-derived short-chain fatty acids. Furthermore, the protocol may also be used for tracking intestinal absorption and liver metabolism of drugs or for measurements of portal blood pressure.

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The access of nutrients, microbiota metabolites and medicines to the circulation is controlled by the gut-blood barrier (GBB). We describe a direct method for measuring the GBB permeability in vivo, which, in contrast to commonly used indirect methods, is virtually not affected by liver and kidney functions.

Une méthode In Vivo pour l’évaluation de la barrière intestinale-sang et le métabolisme hépatique du microbiote produits

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No current animal models of diabetes and oxygen-induced retinopathy develop the full-range progressive changes manifested in human proliferative diabetic retinopathy (PDR). Therefore, understanding of the disease pathogenesis and pathophysiology has relied largely on the use of histological sections and vitreous samples in approaches that only provide steady-state information on the involved pathogenic factors. Increasing evidence indicates that dynamic cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interactions in the context of three-dimensional (3D) microenvironments are essential for the mechanistic and functional studies towards the development of new treatment strategies. Therefore, we hypothesized that the pathological fibrovascular tissue surgically excised from eyes with PDR could be utilized to reliably unravel the cellular and molecular mechanisms of this devastating disease and to test the potential for novel clinical interventions. Towards this end, we developed a novel method for 3D ex vivo culture of surgically-excised patient-derived fibrovascular tissue (FT), which will serve as a relevant model of human PDR pathophysiology. The FTs are dissected into explants and embedded in fibrin matrix for ex vivo culture and 3D characterization. Whole-mount immunofluorescence of the native FTs and end-point cultures allows thorough investigation of tissue composition and multicellular processes, highlighting the importance of 3D tissue-level characterization for uncovering relevant features of PDR pathophysiology. This model will allow the simultaneous assessment of molecular mechanisms, cellular/tissue processes and treatment responses in the complex context of dynamic biochemical and physical interactions within the PDR tissue architecture and microenvironment. Since this model recapitulates PDR pathophysiology, it will also be amenable for testing or developing new treatments.

Here, we present a protocol to study the pathophysiology of proliferative diabetic retinopathy by using patient-derived, surgically-excised, fibrovascular tissues for three-dimensional native tissue characterization and ex vivo culture. This ex vivo culture model is also amenable for testing or developing new treatments.

Un modèle de Culture tissulaire Ex Vivo pour fibrovasculaire Complications dans la rétinopathie diabétique proliférante

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...