Ce protocole est pour trancher et culturer des sections de tissu cardiaque pendant six jours dans des conditions physiologiques qui peuvent être employées pour l’essai aigu de toxicité cardiaque aussi bien que l’efficacité d’essai des thérapies d’arrêt du coeur. Ce système de culture a le potentiel de devenir un puissant modèle in situ humain prédictif pour les tests de toxicité cardiaque aiguë qui comblera l’écart entre les résultats des essais précliniques et cliniques. Qinghui Qu, un directeur de laboratoire de notre laboratoire, démontrera les procédures.
Pour obtenir des tranches de tissu cardiaque de porc, ajoutez d’abord de la glace à la veste de refroidissement du bain de tissu d’un vibratome et ajoutez la solution Tyrode au bain. Utilisez un bocal en plastique d’un litre pour recueillir le ruissellement de glace fondue de la veste de refroidissement de bain de tissu et transférer le coeur de porc à un plateau contenant un litre de solution cardioplégique froide fraîche dans une armoire de biosécurité. Utilisez des scalpels stériles rétractables pour disséquer le cœur pour isoler le ventricule gauche et utiliser des lames de rasoir rectangulaires pour couper le ventricule gauche en blocs d’un à deux centimètres cubes.
Réserver un bloc tissulaire pour le tranchage et placer les morceaux restants de bloc de tissu dans un tube de 50 millilitres de solution tyrode froide sur la glace. Masser délicatement le bloc de tissu réservé et ajouter une à deux gouttes de colle tissulaire au porte-échantillon métallique du vibratome. Collez un morceau de bloc d’agar de 4% avec une surface d’environ un centimètre carré à la colle et ajoutez une à deux gouttes de colle de tissu à l’agar.
Attachez le bloc cardiaque au côté épidardium cardiaque d’agar vers le bas avec le tissu aussi plat contre le support que possible et placez le support de tissu avec le bloc de coeur dans le bain de tranchement du vibratome. Il est crucial de coller le bloc cardiaque à l’agar avec le côté épidardium cardiaque face vers le bas sur la colle tissulaire et de s’assurer que le tissu est aussi plat que possible. Attachez ensuite le tube d’oxygène au bain de tranchage et au plateau métallique rempli de solution Tyrode et placez 40 passoires à cellules micromètres sur le plateau métallique pour recueillir les sections des tissus cardiaques au fur et à mesure qu’elles sont tranchées.
Utilisez le logiciel d’exploitation vibratome pour ajuster la hauteur de la lame et de l’échantillon de sorte que la lame est proche du haut du tissu, mais en dessous des muscles papillaires et le liquide couvre le tissu et la lame. Sélectionnez avance pour ajuster où commencer à trancher le tissu. Appuyez sur la tranche pour augmenter la vitesse et utilisez le bouton pour déplacer la lame vers le bord du tissu.
Appuyez à nouveau sur trancher pour arrêter et avancer pour inactiver le processus. Ajustez ensuite les paramètres de coupe indiqués et pressez la tranche pour commencer à trancher le tissu. Lorsque la lame atteint l’extrémité du tissu, mais avant qu’elle n’atteigne l’extrémité du porte-spécimen, appuyez à nouveau sur trancher pour arrêter et appuyer sur le retour pour revenir à la position de départ.
Lorsque les tranches atteignent toute la longueur et semblent être de bonne qualité, utilisez une pipette Pasteur en plastique remplie de solution tyrode froide pour recueillir doucement le tissu du bain à l’aide de forceps et ciseaux de printemps pour disloquer la tranche du cœur si nécessaire. Placez chaque tranche recueillie dans une passoire à cellules unique dans le bain tyrode oxygéné et utilisez la solution dans la pipette pour presser le tissu sur la surface de la passoire cellulaire. Placez ensuite une laveuse métallique sur le dessus du tissu pour la retenir.
Après au moins une heure dans la solution tyrode oxygénée, couper l’extérieur de chaque tranche pour enlever les bords inégaux et coller l’extrémité de chaque tranche sur un morceau de six millimètres de large de la ceinture de synchronisation de l’imprimante en polyuréthane stérilisée avec des fils métalliques intégrés. Placez les tranches de cœur soutenues dans des plaques de six puits contenant six millilitres de milieu de culture par puits et utilisez des forceps stériles pour vous assurer que le tissu est au centre du puits. Faites en sorte que le couvercle de la plaque ne touche pas le tissu et placez la plaque sur la plaque de culture de sorte que le côté incurvé de la couverture de plaque corresponde avec le côté incliné de la plaque et que les coins carrés s’alignent.
Placer les tranches dans un incubateur de 37 degrés Celsius et de 5 % de dioxyde de carbone. Remplacez les supernatants de culture par six millilitres de culture fraîche oxygénée trois fois par jour. Connectez le couvercle au stimulateur électrique de culture cellulaire et ajustez le stimulateur pour fournir en continu 10 volts d’électricité et une fréquence de 1,2 hertz aux tranches cardiaques.
Après avoir branché la stimulation, les tranches cardiaques commenceront à battre. Tous les jours pendant le changement de milieu de midi, remplacez la couverture de plaque de stimulation du plat de culture pour empêcher la libération des particules toxiques de graphite dans le milieu de culture. Insérez le bouchon de mousse blanche où le couvercle utilisé se connecte au câble pour le stimulateur électrique de culture cellulaire afin d’éviter les dommages causés par l’eau au circuit électrique et placez le couvercle de la plaque dans un bain d’eau autoclavée complété par un antibiotique/antimycotique 2X.
Le lendemain, décontaminer le couvercle de la plaque dans un bain à 70% d’éthanol pendant cinq à 15 minutes avant de transférer le couvercle dans un bain d’eau fraîche autoclavé complété par 2X antibiotique / antimycotique pendant trois minutes. Après le rinçage du couvercle de la plaque, utilisez un lingette propre sans peluche pulvérisée à l’éthanol pour enlever l’eau résiduelle des pièces en plastique et enlever le bouchon de mousse blanche. Le couvercle est alors prêt à être remis dans la plaque de culture.
En utilisant cette nouvelle configuration de culture biomimétique comme démontré, la viabilité des tranches de coeur de porc a été maintenue pendant six jours tel qu’évalué par l’essai de MTT. Dans les six premiers jours, semblables aux réponses observées pour les tranches fraîches de coeur, il n’y a aucun transitoire spontané de calcium dans les cardiomyocytes de tranche de coeur de porc. Les cardiomyocytes ont répondu à la stimulation électrique et bêta-adrénergique externe.
En outre, la force contractile et les réponses à l’isoproterenol ont été maintenues dans la culture de tranche de coeur pendant jusqu’à six jours semblables à celle observée dans les tranches fraîches de coeur. Plusieurs évaluations structurelles et fonctionnelles peuvent être effectuées sur les tranches cardiaques, y compris les tests de viabilité du MTT, l’immunostaining, la microscopie électronique, les mesures transitoires du calcium, les évaluations des fonctions contractiles, les évaluations métaboliques et l’analyse. Nous utilisons actuellement ce système de culture pour tester la toxicité cardiaque aiguë et l’efficacité des médicaments et des thérapies géniques d’intérêt pour les tranches de porc et de cœur humain.
