בדיקות פרה-קליניות של תרופות ברקמות שריר מהונדסות תלת-ממדיות ניתנות להרחבה

הפלטפורמה שלנו משתמשת ברקמות שריר מהונדסות-תלת-ממד ובחומרת חישה מגנטית כדי למדוד התכווצות על פני 24 בארות בו זמנית. זה מספק שיטת תפוקה גבוהה יותר להערכת טיפולים חדשים במבחנה באמצעות רקמות שריר אנושיות. שיטת הליהוק שלנו משפרת את העקביות והשחזור בייצור רקמות שריר מהונדסות-תלת-ממדיות.

תכננו לוח יציקה מתכלה של 24 בארות המצויד בחומרת חישה מגנטית למדידות וניתוח התכווצות בפלטפורמה שלנו. שיטה זו יכולה לספק תובנה חשובה לגבי מודלים של מחלות חוץ גופיות, גילוי תרופות וריפוי גנטי לכל מחלת שרירים המשפיעה על התכווצות. כיום אנו משלבים נוירונים מוטוריים במבנים התלת-ממדיים שלנו כדי ליצור מודל של צומת עצבית-שרירית גם כן.

כדי להתחיל, הניחו ערכת יציקת רקמות מצוננת מראש על גוש קר או קרח בתוך מכסה המנוע של תרבית התא. הניחו את צלחת היציקה שטוחה על קרח. מוסיפים תרומבין למדיום הבסיס כדי ליצור את תמיסת הטרומבין ומעבירים את סריג העמוד מצלחת היציקה לצלחת סטרילית חדשה בת 24 בארות.

פיפטה 50 מיקרוליטר של תמיסת טרומבין לתוך כל באר מקוררת מראש של צלחת היציקה ומניחים את הסריג בחזרה על הערכה. הניחו את ערכת היציקה בצד על קרח. לאחר מכן, להוסיף 500 מיליליטר של מדיום RPMI, 10 מיליליטר של B27, ו 2.5 גרם של חומצה aminocaproic, או ACA, כדי להכין את מדיום EMT הלב.

הוציאו את מדיום החובש שישמש ליציקת הרקמות והוסיפו לו 10 מעכבי סלע מיקרומולאריים. הכן את מדיום EMT השלד על ידי הוספת 50 מיליליטר של מדיום F10 ו 0.25 גרם של חומצה aminocaproic, או ACA, עבור מיובלסטים ראשוניים. השתמש 0.1 גרם של ACA עבור מיובלסטים שמקורם ב- IPSC.

לאחר מכן, מסננים סטריליים את מדיום הליהוק המכיל ACA. לחמם את מגיב הדיסוציאציה בדרגת תרבית תאים ונפח שווה של מדיום EMT ל 37 מעלות צלזיוס. מדיום EMT מחומם זה ישמש לדילול מגיב הדיסוציאציה.

שטפו את התאים עם PBS והוסיפו את מגיב הדיסוציאציה המחומם כדי להרים את התאים. דוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות או עד שהתאים מתרוממים ובודקים את התרביות כל שתיים-שלוש דקות על ידי הקשה על צד הצלחת. לאחר שהתאים התרוממו, העבירו אותם לצינור חרוטי של 50 מיליליטר.

עשו טריטורציה עם פיפטה P-1000 כדי להבטיח השעיה של תא יחיד. שטפו את הצלחת ואת הבקבוק עם מדיום EMT נוסף כדי לאסוף את התאים הנותרים ולהוסיף אותם לצינור החרוט. שוב, שלשו את התאים כדי להבטיח השעיה של תא בודד.

הוסף מדיום EMT כדי לסיים את תהליך הדיסוציאציה ולאחר מכן לקחת דגימות של השעיות התא עבור ספירת תאים. בצע ספירת תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר בכחול טריפאן. סובב את התאים ב 200 G במשך ארבע דקות, לשאוף את supernatant, ולהשעות מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של תווך הבסיס EMT כדי להסיר את מגיב דיסוציאציה שיורית.

לאחר צנטריפוגה נוספת במשך ארבע דקות, שואפים את הסופרנאטנט ומכינים את מתלי התא בצפיפויות המתאימות. חישוב הנפחים של כל תמיסת תא הנדרשת כדי לפצות על מספר הרקמות הרצוי פיפטה את הכרכים המחושבים של תאים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. הוסף 10 מיקרוליטר פיברינוגן לכל EMT לתרחיף התא והנח אותו על קרח.

ודא כי לכל חובש יש 90 מיקרוליטר של השעיית תאים, 10 מיקרוליטר של פיברינוגן, ו 50 מיקרוליטר של תמיסת תרומבין במבנה הרקמה הסופי. במכסה מנוע של תרבית תאים, הסירו את מכסה ערכת יציקת הרקמה והניחו את צלחת היציקה כשסריג העמוד מונח שטוח על הקרח. מערבבים את תערובת פיברינוגן התא לצייר 100 מיקרוליטר עם פיפטה P-200.

מוסיפים 100 מיקרוליטר מהתערובת לבארות שהוכנו עם 50 מיקרוליטר של תמיסת תרומבין וטריטוראט חמש פעמים כדי לערבב היטב. אין לדחוף את הפיפטה מעבר לתחנה הראשונה ולהסיר את הקצה לאחר הטריטורציה כדי למנוע יצירת בועות. מערבבים את תרחיף התא בצינור החרוטי לפני יציקת כל רקמה.

החזיקו את הסריג ואת צלחת היציקה בו זמנית באמצעות אצבע מצביעה ואגודל של יד אחת כדי למנוע כל תזוזה של הסריג או השאירו את הצלחת שטוחה על קרח ונענעו את דלי הקרח כדי לראות לתוך צלחת היציקה. חזור על הפעולה עם קצה P-200 טרי לכל רקמה עד שכל הרקמות יצוקות. מעבירים בזהירות את ערכת הזרעים לאינקובטור ודגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 80 דקות.

לאחר מכן, להכין צלחת 24 באר טרי עם שני מיליליטר לכל באר של מדיום EMT עבור רקמות הלב לדגור את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס כדי לחמם את המדיום. לאחר הדגירה של 80 דקות, מוסיפים בעדינות מיליליטר אחד של מדיום החובש לקצה בארות היציקה ודגרים במשך 10 דקות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 10 דקות של דגירה, בזהירות להרים את הסריג פוסט ולהעביר את הרקמות מן צלחת יציקה צלחת מוכן 24 בארות עם המדיום מחומם.

לבסוף, להחזיר את הצלחות עם רקמות לאינקובטור תרבית התא ב 37 מעלות צלזיוס. ייצור EMT לא מוצלח יכול לנוע בין כשלים קטסטרופליים כגון ניתוק רקמות מהעמדות, לפגמים מבניים עדינים יותר כגון בועות אוויר ושקיעת רקמות לא שוות סביב שני העמודים. מבנה EMT יום לאחר היציקה מוצג כאן.

רקמות שרירי השלד הועברו למדיום התמיינות החל מהיום אפס של איחוי תאים ודחיסת הידרוג'ל. מהיום השביעי ועד היום ה-28, אותו חובש הציג אורך כולל מעט קצר יותר בין שתי העמדות ורוחב קטן יותר כאשר נמדד דרך החלק האמצעי של החובש. ארבע פלטות של רקמות היו במעקב במשך 21 ימים והשוו את קוטר החובשים לאורך הדחיסה.

נקודות זמן מציגות גודל EMT עקבי בין הלוחות. דחיסה מקסימלית מושגת ביום ה -21 כאשר שיפוץ המטריצה מתייצב. האימונוהיסטוכימיה של החובשים מתוארת כאן.

החובשים תוקנו ביום 10 לתרבית והוטמעו בפרפין. חתכים דקים הוכתמו בנוגדנים נגד מיוזין, שרשרת כבדה ודיסטרופין לפני ההדמיה. תמונות גרפיות אלה מייצגות את כוח העווית המוחלט הממוצע שנמדד מהחובשים הלבביים ומחובשי השלד לאורך זמן.

טיפול דוקסורוביצין אקוטי וכרוני ברקמות לב מהונדסות מוצג כאן. שלושה ריכוזי מינון שונים של דוקס ניתנו בבולוס או שניתנו ברציפות לרקמות לב מהונדסות, במשך 27 ימים. תגובת המינון ל- BDM ברקמות שרירי שלד מהונדסים מוצגת באיור זה.

קצב פעימות הלב או תדירות העוויתות נפסק באופן תלוי מינון בד בבד עם הפסקת כוח התכווצות המציין רעילות לב כאשר חובשים נחשפים לתרכובת זו. הדברים החשובים ביותר שיש לזכור בעת יציקת רקמות הם לשמור על הכל קר בכל עת, כולל מתלה התא והריאגנטים שלך ולשמור על הסריג שלאחר מכן נייח לחלוטין ברגע שהיציקה מתחילה.